硫酸氨基葡萄糖对IL-1β诱导人骨关节炎软骨细胞合成IL-1Ⅱ型受体和IL-1Ra的影响(1) |
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| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
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王晓滨，黄公怡，薛庆云，孙常太 【摘要】 目的 研究硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）对IL-1β诱导体外培养的人骨关节炎软骨细胞合成HOC中Ⅱ型白介素1受体（interleukin-1 receptor type Ⅱ，IL-1RⅡ）和白介素1受体抗体（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）的影响。方法 取10例骨关节炎患者行全膝关节置换术的股骨髁和胫骨平台软骨标本，酶消化法获取软骨细胞进行体外培养。在原代或第二代的人软骨细胞培养液中加入IL-1β（5ng/ml）和不同浓度的GS（2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，应用ELISA法检测GS对IL-1β诱导HOC合成白介素1受体抗体，应用RT-PCR法检测HOC中Ⅱ型白介素1受体（interleukin-1 receptor type Ⅱ，IL-1RⅡ）的mRNA表达。 结果 IL-1β刺激软骨细胞合成IL-1Ra增加（P＜0.01），合成IL-1RⅡ mRNA下降（P＜0.05）。与对照相比，2mmol/L和20mmol/L的GS均能抑制IL-1β刺激软骨细胞表达IL-1RⅡ mRNA下调(P＜0.01），而且这种修饰以浓度依赖的方式起作用(P＜0.01），而0.2mmol/L的GS不能影响IL-1β下调IL-1RⅡ mRNA的表达(P＞0.05）。单独使用20mmol/L的GS对软骨细胞表达IL-1RⅡmRNA无影响(P＞0.05）。0.2mmol/L、2mmol/L和20mmol/L的GS对IL-1β刺激软骨细胞合成IL-1Ra均无影响(P＞0.05）。结论 硫酸氨基葡萄糖能够拮抗IL-1β对人骨关节炎细胞合成IL-1RⅡ的向下调节，但不影响IL-1Ra的表达；这可能是硫酸氨基葡萄糖能保护软骨的机制之一。
【关键词】 骨性关节炎；硫酸氨基葡萄糖；软骨细胞；IL-1RⅡ
【Abstract】 Objective To study the effects of glucosamine sulfate modulating IL-1β induced expression of IL-1Ra and IL-1RⅡ in human osteoarthritic chondrocytes cultured in vitro. Methods Chondrocytes were harvested from ten OA patients undergone TKR operation and cultured in monolayer cultures. Human recombinant IL-1β（5ng/ml）and GS in different concentrations （2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）were administrated into culture medium of the first or second passage cells. IL-1Ra in the culture medium was evaluated by ELISA，and IL-1RⅡ mRNA expression was examined by RT-PCR.Results Stimulation of human osteoarthritic chondrocytes with IL-1β for 24 hours resulted in significant enhanced production of IL-1Ra (P＜0.01) and decreased expression of IL-1RⅡ mRNA (P＜0.05). Pretreatment with 2mmol/L or 20 showed a dose-dependent inhibition of IL-1β induced down regulation of IL-1RⅡ mRNA expression (P＜0.01) while 0.2 mmol/L GS had no such effect(P＞0.05）. GS did not affects expression of IL-1Ra，either(P＞0.05）.Conclusion GS inhibits IL-1β induced down regulation of IL-1RⅡexpression in human osteoarthritic chondrocytes. Our result reveals the possible mechanism of GS as a symptom and structure modifying drug in the treatment of OA.
骨关节炎是老年人最常见的关节疾病，它以软骨结构破坏为特征，最终导致关节功能障碍。致炎因子IL-1β和它作用于软骨细胞和滑膜细胞产生的其他炎性介质，干预了细胞外基质的转化，加速了软骨基质的降解，诱发软骨细胞凋亡［1］，被认为是骨 关节炎中诱发和维持软骨损坏的关键因子［2］。
IL-1β的炎症效应要通过细胞浆内IL-1Ⅰ型受体来介导。IL-1Ⅱ型受体虽然也能与IL-1结合，但作为被裁切过的蛋白，它不能产生信号；白细胞介素1受体拮抗物（IL-1Ra）能与Ⅰ型受体特异结合，但没有类白细胞介素1的活性。因此，调节IL-1Ra 和IL-1Ⅱ型受体的合成就成为阻断IL-1的炎症效应靶标之一［3］。
氨基葡萄糖（硫酸或盐酸）(glucosamine sulfate or chloride，GS)是治疗骨性关节炎的常用药，它具有保护软骨的特性，并被认为能修复损伤的软骨。但就目前为止，它在体内、外作用机制均不详。本研究拟通过观察硫酸氨基葡萄糖是否影响IL-1β诱导人骨关节炎软骨细胞合成IL-1Ⅱ型受体和IL-1Ra来探讨GS的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 3-硫酸氨基葡萄糖，购自Sigma公司。胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DMEM培养基、胎牛血清和Trizol Reagent购自Gibco公司。重组人IL-1beta、反转录试剂盒A3500购自 Promega公司。IL-1Ra ELISA试剂盒购自R&D公司。PCR引物由北京赛百盛生物工程公司合成。CO2培养箱，丹麦Heto。酶标仪，美国BIO-RAD。PCR仪，美国Perkin Elmer，GeneAmp9600，基因测定仪、凝胶成像系统和计算机图像分析系统，美国Pharmacia Biotach。电泳槽，美国Bio-Rad。
1.2 软骨细胞培养 10例原发性骨关节炎住院患者（平均年龄67.3岁），行全膝关节置换术切割下来的股骨髁和胫骨平台标本，在预冷的无菌PBS液中将软骨修剪成0.1mm3大小，0.25%的胰蛋白溶液37℃水浴中孵育30min，离心弃上清后加入0.2%胶原酶溶液，37℃恒温摇床中孵育6h以上。应用DMEM培养液冲洗收获的细胞3次，计数，以2×105/ml的细胞密度接种于25cm2培养瓶中，加入含20% FCS的DMEM 5ml，放入37℃含5%的CO2的细胞培养箱中培养。
1.3 实验分组和给药方法 取培养的第二代细胞按5×105/ml的密度接种在25cm2培养瓶或六孔板中，随机分组，细胞生长至80%汇合时更换培养液为不含FCS的DMEM，让细胞饥饿过夜，然后同时加入IL-1β（5ng/ml）和不同浓度的GS（2mmol/L，10mmol/L，20mmol/L）作用24h，离心，重复取上清后冷冻（-70℃）备用（检测PGE2），细胞用以提取RNA或裂解蛋白。
1.4 ELISA法检测软骨细胞上清中IL-1Ra含量 按试剂盒要求操作，每孔各加入待测细胞上清液200μl，在450nm处测吸光度（OD）值，在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应人IL-1Ra含量。
