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大肠埃希菌产PER1型超广谱β内酰胺酶的研究(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 胡龙华 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
【摘要】 目的 检测大肠埃希菌产PER1型超广谱β内酰胺酶的发生率及其耐药特点。方法 采用双纸片增效确证试验进行超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的表型检测，对表型阳性菌株用聚合酶链反应(PCR)和PCR产物测序方法确定超广谱β内酰胺酶的基因型。结果 167株大肠埃希菌中有50株产ESBLs，占29.9%(50/167)；6株产PER1型ESBLs，占3.6%(6/167)。6株产PER1型ESBLs大肠埃希菌均对头孢他啶和头孢噻肟耐药，5株对头孢西丁耐药，4株对阿米卡星敏感，全部菌株对亚胺培南敏感。结论 大肠埃希菌中检测到产PER1型超广谱β内酰胺酶，且其耐药和多重耐药性严重，应引起重视。
【关键词】 大肠埃希菌 PER1 β内酰胺酶 耐药基因型
Study on PER1 type extendedspectrum βlactamase produced
ABSTRACT Objective To investigate the prevalence of PER1 type extended spectrum βlactamases (ESBLs) and its antimicrobialresistance profile in Escherichia coli. Methods One hundred and sixtyseven strains of Escherichia coli were tested. All of them were isolated from all kinds of clinical specimens from four hospitals of Nanchang city from August 2002 to June 2003. Antimicrobial susceptibility tests (AST) were determined by KirbyBauer disk diffusion test. Doubledisk test and threedimension extraction test were used to determine ESBLs. blaPER1 genes were amplified by PCR. The products of PCR were sequenced to identify the βlactamase genotype. Results The positive rates of ESBLs in Escherichia coli were 29.9% (50/167). Six isolates carried blaPER1 gene. The blaPER1 gene positive rates of Escherichia coli is 3.6% (6/167). Among 6 isolates carring blaPER1, all were resistant to cefotaxime and ceftaxidime, 2 resistant to amikacin, 5 resistant to cefoxitin and all sensitive to imipenem. Conclusion PER1 βlactamases and their encaling genes are detected in Escherichia coli. The isolates harbouring blaPER1 are resistant to many antibiotics.
KEY WORDS Escherichia coli; PER1; βlactamases; Resistance genotype收稿日期：20060418
大肠埃希菌是临床常见病原菌，特别是其高产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)及多重耐药性己引起临床广泛关注，产ESBLs大肠埃希菌株不断增多，且可通过质粒造成耐药性的跨菌种播散，对医院感染构成严重威胁。1993年Nordmann等首次从法国分离的铜绿假单胞菌中检出PER1型ESBLs，1997年Vahaboglu等［1］在土耳其的一次普查中发现72株不动杆菌中有33株产PER1型ESBLs， 检出率达45.8%，2002年我国蒋晓飞等［2］在鲍曼不动杆菌中检出PER1型ESBLs。目前，关于肠杆菌科细菌产PER1型ESBLs研究较少。我们对南昌地区2002年8月～2003年5月临床分离到的167株大肠埃希菌进行了PER1型ESBLs基因型的检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)试验菌株和质控菌株 收集2002年8月～2003年5月江西医学院第一附属医院、第二附属医院、江西省人民医院和南昌市第一人民医院临床标本中分离到的大肠埃希菌167株；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、产SHV18型ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603、产PER1型ESBLs鲍曼不动杆菌(上海瑞金医院倪语星教授惠赠)。
(2)抗生素药敏纸片 亚胺培南(IMP)、头孢吡肟(CPE)、头孢西丁(CFX)、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)(购自Oxoid公司)；氨苄西林(ABPC)、阿奇霉素(AZM)、环丙沙星(CPLX)、克林霉素(CLDM)、氨曲南(AZ)、呋喃妥因(NFT)、阿米卡星(AMK)购自北京天坛药物生物技术开发公司。
(3)PCR引物 由上海博亚生物公司合成，序列如下：
blaTEMA：5′GAGTATTCAACATTTCCGTGTC3′
blaTEMB：5′TAATCAGAGAGTGAGGCACCTAT
CTC3′
blaSHVA：5′TGGTTATGCGTTATATTCGCC3′
blaSHVB：5′GCTTAGCGTTGCCAGTGCT3′
blaPER1A：5′AATTTGGGCTTAGGCTTAGGG
CAGAA3′
blaPER1B：5′ATGAATGTCATTATAAAAGC3′
blaVEB1A：5′CGACTTCCATTTCCCGATGC3′
blaVEB1B：5′GGACTCTGCAACAAATACGC3′
(4)主要仪器 Vitek32全自动微生物分析仪(法国BioMerieux公司)、PCR扩增仪(美国PE公司)、双向电泳分析仪(美国BioRad公司)、Tanon凝胶成像系统(上海天能公司)。
1.2 方法
(1)菌株鉴定及药敏试验 所有菌株分别由各单位的全自动微生物分析仪进行鉴定，接种至半固体培养基，-20℃保存。药敏试验由本室采用纸片扩散法集中测定，严格按照美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)的标准判断结果，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
(2)ESBLs表型确证试验 分别将头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTX/CA)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CA)药敏纸片贴于涂有被测菌的MH平板上，35℃孵育16～18h观察结果，若CAZ/CA比CAZ或CTX/CA比CTX的抑菌环大于或等于5mm以上即为ESBLs阳性，确证试验符合CLSI/NCCLS2001年(M100S11 2001)规定的方法。
(3)DNA模板制备 取已分纯的菌落２～3个，加入100μl PBS缓冲液中，制备浓菌液。用PBS缓冲液洗涤2次，煮沸15min，释放DNA。
(4)PCR扩增耐药基因 PCR反应总体积为50μl，其中引物1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTP(200μmol/μl)1μl，Mg2 2.5mmol/L，Taq酶2.5μl，DNA模板2μl，双蒸水38.5μl。扩增条件为：94℃初变性4min，然后94℃变性45s，退火温度blaTEM为57℃，blaSHV为55℃，blaPER1为50℃，blaVEB1为55℃，时间为30s，72℃延伸45s，进行25个循环最后延伸10min，PCR产物在0.7%的琼脂糖凝胶中进行电泳后，用凝胶成像系统观察结果。
(5)PCR产物测序 PCR扩增原液经上海博亚生物公司纯化后，用ABIPRISM377DNA测序仪进行正反双向测序，测序结果在GenBank中经BLAST标准核酸核酸程序和核酸蛋白质程序分析，以确定基因型别。
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