【关键词】 酵母发酵液；不对称还原反应；4

　　Optimization for the asymmetric synthesis of (S)ethyl 4chloro3hydroxybutanoate directly catalyzed by yeast fermentation broth

　　【Abstract】 AIM: To optimize the asymmetric reduction of ethyl 4chloro3oxobutanoate (COBE) to (S)ethyl 4chloro3hydroxybutanoate ［(S)CHBE］ directly catalyzed by yeast (Saccharomyces cerevisiae) fermentation broth. METHODS: The variation of COBE, (S)CHBE and reductive sugar in reaction course and the influence of some reaction conditions (substrate, energy source) on asymmetric synthesis of (S)CHBE directly catalyzed by yeast fermentation broth were examined respectively, and the optimal conditions of asymmetric synthesis of (S)CHBE were optimized by orthogonal test design. RESULTS：The consumption of substrate and formation of product were mostly in the initial reaction course as well as consumption of reductive sugar. Repeated feeding strategy of substrate and energy source was favored for the formation of (S)CHBE. The optimum reaction conditions were sucrose repeated feeding strategy Ⅱ (feeding 5 g/120 mL after 2 h of reaction), substrate feeding strategy Ⅳ［0.5(3)］, buffer concentration 2 g/120 mL, βcyclodextrin concentration 2 g/120 mL. CONCLUSION: Optically active (S)CHBE is synthesized by yeast fermentation broth with 96% yield and 100% ee (enantiometric excess) under the optimum reaction conditions.

　　【Keywords】 yeast fermentation broth; asymmetric reduction; ethyl 4chloro3oxobutanoate; (S)ethyl 4Chloro3hydroxybutanoate; orthogonal text

　　【摘要】 目的：优化酵母发酵液直接催化4氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)4氯3羟基丁酸乙酯((S)CHBE)的反应条件. 方法：考察酵母发酵液催化该反应过程中基质变化的规律，研究底物和能源供体对反应的影响，并通过正交实验设计法优化反应条件. 结果：在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中，底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期；反复分批式添加底物和蔗糖有利于反应效率的提高；正交实验优化反应条件的结果表明：酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)CHBE的最佳反应条件为：蔗糖添加方式Ⅱ（反应开始2 h后添加5 g/120 mL），底物添加方式Ⅳ［0.5(3)］，缓冲剂添加量2 g/120 mL，β环糊精添加量为2 g/120 mL，反应后测定产物的产率达96%，ee(对映体过量值)达100%. 结论：通过反应条件优化提高了酵母发酵液的催化效果.

　　【关键词】 酵母发酵液；不对称还原反应；4氯乙酰乙酸乙酯；(S)4氯3羟基丁酸乙酯；正交实验

　　0引言

　　近年来，通过生物催化剂［1-3］催化羰基化合物的不对称还原反应合成光学活性醇的相关研究备受关注. 其中，(S)CHBE是合成降血脂、降胆固醇、心血管药及抗生素等药物的光学活性中间体，市场需求很大. 有关利用酵母干细胞和基因工程菌催化COBE不对称还原反应合成(S)CHBE的报道多为基础性研究［4-5］. 我们在前期研究酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)CHBE反应的基础上［6］，进一步考察反应过程中基质的变化规律和底物、能源供体及添加方式对反应的不同影响，优化反应条件，为建立成熟的生产操作工艺条件奠定技术基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Na2CO3为市售化学纯，其他材料参照文献［6］的实验部分1.1试剂.

　　1.2方法

　　1.2.1目标化合物的合成路线酵母发酵液催化COBE的不对称还原反应合成(S)CHBE的合成路线为：

　　1.2.2生物催化剂制备参照文献［6］实验部分1.2的方法培养酵母发酵液作为生物催化剂.

　　1.2.3酵母发酵液催化COBE不对称还原反应合成(S)CHBE反应条件和过程基本参考文献［6］实验部分1.3 COBE的不对称还原反应，其中手性添加剂改为β环糊精1.2 g，缓冲剂改为K2HPO4Na2CO3（8/2, m/m） 1 g, 其他反应条件改为文献［6］报道的优化条件，即：酵母菌最佳培养时间为16~18 h，最佳反应温度和pH值分别为29~31℃和7.2.

　　1.2.4底物和产物浓度测定参照文献［6］实验部分1.3.

　　1.2.5反应产物产率和光学纯度的分析计算以产物产率（Y）和对映体过量值（ee）表示反应的程度和产物的光学纯度，其表达式分别如下：
Y=nsCHBE〖〗nCOBE×100%
式中nCOBE为反应初始时底物COBE的摩尔数，nsCHBE为反应结束后产物(S)CHBE的摩尔数.
ee=cS-cR〖〗cS cR×100%，式中cS和cR分别为S型和R型产物的浓度.

　　1.2.6还原糖测定采用DNS法.

　　1.2.7酵母发酵液催化不对称还原反应（VCOBE=1.5 mL）的条件优化采用正交实验设计法安排实验考察底物和蔗糖添加方式、β环糊精和缓冲剂（K2HPO4Na2CO3（8/2，m/m）)添加量等因素对酵母发酵液催化1.5 mL COBE（相当于91 mmol/L）不对称还原反应合成(S)CHBE反应的影响. 底物添加方式分别考察：Ⅰ 一次性加入底物1.5 mL；反复分批式补加底物（包括:Ⅱ 开始时加入1.0 mL，在反应进行2 h后再补加0.5 mL；Ⅲ 反应开始时加入1.0 mL，反应开始4 h后再补加0.5 mL;Ⅳ 反应开始时加入0.5 mL，后每间隔2 h加入0.5 mL两次,即0.5 (3)）. 蔗糖添加方式分别考察：Ⅰ 一次性加入15 g；反复分批式补加（包括:Ⅱ 反应开始时加入10 g，反应进行2 h后再补加5 g；Ⅲ 反应开始时加入10 g，反应开始4 h后补加5 g等方式）. 选择L9(34)正交表进行表头设计、安排和实施试验.

　　统计学处理：用正交设计助手Ⅱv3.1（专业版）统计软件分析（F检验）实验结果.

　　2结果

　　2.1COBE不对称还原反应过程中的基质变化规律在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应合成(S)CHBE的反应过程中，底物和产物随反应时间的变化规律（图1）显示：在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中，底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期，在反应开始前4 h内，底物消耗快，产物生成多，在反应后期，两者的变化都不是很明显；还原糖在反应开始后的前3 h内下降很快，后期的变化不明显. 因此,在反应条件控制优化中要注意反应过程前期工艺条件的控制，降低反应的初始底物浓度，提高反应效率. 从多次实验看，反应时间为7 h为好.

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