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环孢菌素A两种不同产生菌原生质体的制备和再生(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：林永勉 郑孝贤 郑卫 程元荣
【摘要】 以环孢菌素A两种不同产生菌——雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，开展了原生质体制备和再生条件的研究，并分别实现了两个不同种的菌株原生质体再生。
【关键词】 环孢菌素A 雪白白僵菌 茄病镰刀菌 原生质体
Formation and regeneration of protoplasts from two
ABSTRACT Protocols for formation and regeneration protoplasts for two different fungus species, Beauveria nivea and Fusarium solani, were described. High yield of protoplasts was obtained by using a combined enzyme system containing lywallzyme and snailase. The effects of factors such as osmotic stabilizers, cultivation time, temperature, pH, incubation time on the formation and regeneration were studied.
KEY WORDS Cyclosporin A; Beauveria nivea; Fusarium solani; Protoplast
环孢菌素A(cyclosporin A)是由11个氨基酸组成的环肽，已作为高效免疫抑制剂在人体器官移植上广泛应用［1］。1976年瑞士Sandoz公司首次报道了由半知菌属多孔木霉(Tolypocladium inflatum)［后更名为雪白白僵菌Beauvcria nivea)］和光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)产生的环孢菌素A［2］。此后各国的科学家又陆续报道了由13种其他产生菌，如茄病镰刀菌(Fusarium solani)和侵菅新赤壳菌(Neocosmospora varinfecta)等产生环孢菌素A。福建省微生物研究所于1983年首次报道了从我国土壤中筛选到环孢菌素A的产生菌茄病镰刀菌411，在国内率先研制成功环孢菌素A［3，4］。根据Ains worth的真菌分类法，茄病镰刀菌和国际上常用的环孢菌素A产生菌雪白白僵菌分别属于丝孢纲(Hyphomycetes)的丝孢目(Hyphomycetales)和瘤座孢目(Tuberculariales)。这两种产生菌不但在形态、培养特征和生理特性上有所不同， 而且在工业化生产工艺和结果各有不同的特点。茄病镰刀菌生产环孢菌素A具有发酵培养基成本低，发酵周期短(5d)的优点，但环孢菌素A效价和组分含量偏低；雪白白僵菌生产环孢菌素A具有环孢菌素A效价和组分含量较高的优点，但发酵培养基成本高，发酵周期长(10～15d)。Kim等［5］利用雪白白僵菌进行种内融合，所获得的依赖LVal和LLeu的融合株环孢菌素A效价高达8920 mg/L，但发酵所需的培养基价格昂贵，使用培养基中氨基酸含量高达36g/L，发酵周期长达10～13d。我们设想将两种不同的环孢菌素A产生菌的菌种进行目间原生质体融合，试图筛选出集合两个不同菌种优点的融合子应用于生产，获得提高环孢菌素A生产能力和经济效益的新菌株。本文报道以雪白白僵菌和茄病镰刀菌为出发菌株，分别进行原生质体制备与再生条件的研究。
1 材料和方法
1.1 菌种
茄病镰刀菌S421502和雪白白僵菌X44150均由福建省微生物研究所提供。
1.2 培养基
PDA液体培养基 称取20g去皮土豆，切成小块状，加适量水煮30min。用4层纱布过滤，弃去滤渣，于滤液中加入2g葡萄糖，定容到100ml。
PDA斜面琼脂培养基 100ml PDA液体培养基加琼脂2g进行制备。
PDA再生培养基 PDA液体培养基，酵母浸汁(膏状)0.3g，KCl 3.9g，琼脂2g，定容至100ml。
1.3 试剂
纤维素酶(cellulase)厦门泰京生物技术有限公司；蜗牛酶(snailase)厦门泰京生物技术有限公司；溶壁酶(lywallzyme)广东省微生物研究所；二硫苏糖醇(DDT)厦门泰京生物技术有限公司。
渗透压稳定剂分别为0.6mol/L的KCl、NaCl、MgSO4·7H2O、D甘露醇、D山梨醇和蔗糖溶液。
1.4 原生质体的制备
分别挑取一环雪白白僵菌和茄病镰刀菌斜面琼脂培养物接种于PDA液体培养基中，摇瓶装量为40ml/250ml三角瓶，26℃、200r/min培养一定时间后投入若干个直径为0.3mm的玻璃珠，振荡20min。用玻璃砂心漏斗G3过滤。取0.2g湿菌体，加入1ml 0.01mol/L的DDT，混匀，静置20min后10000r/min离心10min，弃去上清液，将菌丝体沉淀悬浮于2ml无菌水中，10000r/min离心10min。弃去上清夜，加入1ml不同的酶溶液，混匀，置于28℃水浴锅中，每小时用吸管吹吸3次，血球计数板计数。酶解结束后补加1ml 0.6mol/L KCl，吹吸3次，用3层擦镜纸过滤，滤液转入到离心管中。3000r/min离心7min，弃去上清液，将原生质体悬浮于1ml 0.6mol/L KCl中，血球计数板计数。
1.5 原生质体的再生
将制备好的原生质体悬浮液用0.6mol/L KCl溶液作适当稀释，于PDA再生培养平板上涂布0.1ml；原生质体再生对照系将原生质体用无菌水进行低渗处理，后涂布于再生培养基上。26℃培养5～7d观察再生菌落，同时进行再生菌数计数：
再生率=实验组再生菌落数-对照组再生菌落数原生质体数×100%
2 结果与讨论
2.1 酶液组成对原生质体形成的影响
采用溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶组成9组酶液分别酶解菌龄为24h的雪白白僵菌和茄病镰刀菌菌丝，以0.6mol/L的KCl为稳定剂(pH6.0，反应温度28℃，反应时间4h)，结果见表1。
由表1看出，溶壁酶与蜗牛酶混合液酶解菌体时，形成原生质体量最多。不同种类的真菌制备原生质体所需条件和生成的量相差较大，雪白白僵菌形成原生质体需要酶浓度较低(0.5%溶壁酶 0.5%蜗牛酶)，形成原生质体较多，达到8.0×107个/ml(图1A)。茄病镰刀菌在较高浓度酶液(1%溶壁酶 1%蜗牛酶)中形成5.3×105个/ml原生质体(图1B)。利用复合酶进行破壁，效果比单个酶作用要好。单用纤维素酶或蜗牛酶作用于菌丝体未发现原生质体的产生，而单用溶壁酶可以水解细胞壁结构产生原生质体，并且在蜗牛酶辅助作用下原生质体数量达到最多。
2.2 菌龄对原生质体形成的影响
菌龄是制备原生质体过程中重要的因素。以0.6mol/L的KCl为稳定剂(pH6.0，反应温度28℃)，4h后观察，结果如图2。在26℃培养28h的雪白白僵菌或培养16h的茄病镰刀菌菌丝制备的原生质体量最多，表明该时期细胞壁结构正适合于制备原生质体。对表1 酶液组成对原生质体形成的影响数期前的菌丝细胞结构对降解酶不敏感，细胞壁和原生质体膜难于分离，造成原生质体释放困难［6］。处于对数生长期的年轻菌丝易于酶解，此时菌丝体内源溶壁酶分泌量大，有利于原生质体的释放［7，8］。
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