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葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：谢平，葛素梅，沈云峰，顾中华，穆会君，张滨
【摘要】 本研究旨在观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase ,GCS）基因及其蛋白在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。首先以β-actin基因为内参照物，采用RT-PCR方法分析了53例耐药/非耐药白血病患者外周血标本，并对药物敏感的HL-60细胞株和对阿霉素耐药的HL-60/ADR细胞株中GCS基因的表达水平进行检测，同时与多药耐药基因（mdr1）的表达进行比较。继而采用Western blot法分析HL-60细胞株及HL-60/ADR细胞株中GCS蛋白及P-gp蛋白的表达情况。结果表明：白血病患者耐药组临床标本中的GCS基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P<0.05），且GCS基因扩增条带光密度值显著增强时往往伴有mdr1基因的高表达，两者呈正相关（P<0.01、r＝ 0.6）。HL-60/ADR细胞株GCS mRNA及蛋白均过度表达，且明显高于HL-60细胞株，与此同时， HL-60/ADR细胞株的mdr1 mRNA和P-gp的表达亦显著增高。 结论：GCS可能在白血病多药耐药中起着重要作用。
【关键词】 葡萄糖神经酰胺合成酶；多药耐药 ；白血病 ；HL-60细胞；HL-60/ADR细胞
Relation Between Glucosylceramide Synthase and Multidrug Resistance in Leukemia Cells
AbstractThis study was purposed to explore the expression of glucosylceramide synthase (GCS) in human leukemia cells and its relationship with multidrug resistance. RT-PCR was used to analyze peripheral blood samples from 53 leukemia patients with multidrug resistance/non-resistance, and to detect the expression level of GCS gene in HL-60 cells and HL-60/ADR cells, the expression level was compared with the level of mdr-1. The expressions of GCS protein and P-gp prolein in HL-60 cells and HL-60/ADR cells were assayed by Western blot analysis. The results showed that the relative optical density ratio of GCS gene amplified bands in samples of leukemia patients with drug- resistance was significantly higher than that in samples of leukemia patients with drug non-resistance group (P<0.05), meanwhile the significant enhancement of optical density value of GCS gene amplified bands accompamied by high expression of mdr-1 gene. Their correlation showed positive (P<0.01, r=0.6). The GCS mRNA and protein were overexpressed in HL-60/ADR cells, and their expression levels were obviously higher than that in HL-60 cells, meanwhile the expression of mdr-1 mRNA and P-gp also significanfly increased in HL-60/ADR cells. It is concluded that the high level of GCS in leukemia patients possibly is associated with multidrug resistance of leukemia cells.
Key wordsglucosylceramide systhase; multidrug resistance; leukemia; RT-PCR; Western blot analysis
化疗是治疗白血病的主要手段，而多药耐药（multidrug resistance, MDR）导致的化疗失败则是白血病治疗中困扰临床的重大难题。目前国内对MDR的研究较集中在药物转运泵的作用致药物外排增加从而产生耐药。为了进一步探讨白血病耐药的相关机制及寻找逆转白血病细胞耐药的靶标，我们将从另一条新的途径即神经酰胺信号系统中葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase, GCS）的表达水平对白血病细胞耐药作用进行研究。
材料和方法
临床标本
53例白血病患者标本全部来自无锡市第一人民医院，其中男31例，女22例，年龄18-82岁。经临床、细胞形态学、免疫学等项检查，符合全国统一的白血病诊断标准。 治疗缓解标准按照 1987 年全国白血病防治研究协作会议拟订的白血病疗效标准规定，未达到缓解标准为耐药。在53例中耐药27例，非耐药26例。
细胞株
包括人类白血病细胞株HL-60及阿霉素耐药株HL-60/ADR。
细胞培养
将细胞维持在含10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液里，并置于37℃，5％ CO2的培养箱中进行细胞培养和传代。
RT-PCR mRNA 分析
RNA抽提采用TRIzoL提取法抽提外周血标本的单核细胞及培养细胞的总RNA，并通过检测其在A260和A280处的吸光度，计算RNA含量及纯度。
引物设计利用计算机软件primer premier 5.0辅助设计3对引物，经BLAST比对确认其特异性后由上海生工生物公司合成，其核苷酸序列见表1。Table 1. Oligonucleotide sequences of primers for GCS, mdr1 and β-actin（略）
RT-PCR 扩增使用随机引物对GCS 、mdr1及β-actin基因的mRNA进行逆转录反应。PCR扩增条件为：94℃ 5分钟, 94℃ 60秒, 55℃ 45秒, 72℃ 45秒,共30个循环，72℃ 5分钟。
PCR扩增产物检测RT-PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶上经100 V恒压电泳30分钟后，取出该凝胶在凝胶分析系统上拍照，分析各样本扩增条带的光密度值。
Western blot 分析
蛋白质样品制备将细胞培养至3×107，去除培养液并用PBS 溶液冲洗2遍。使用1 mmol/L的冷TNT溶液（20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 200 mmol/L NaCl, 1.0% Triton X-100, 1.0% mmol/L PMSF, 1.0%抑蛋白酶肽）裂解细胞，60分钟 后经12 000×g离心 15分钟以去除未溶解的细胞碎片，并收集上清液测定其蛋白浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳取150 μg总蛋白上样进行SDS- PAGE（Invitrogen公司产品），于125 V恒压电泳90分钟以分离蛋白质样品。
蛋白质电转移及免疫学检测经25 V，2小时电转移后，用封闭试剂（3％去脂奶粉，10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 150 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20）对转移膜进行封闭。分别使用抗GCS抗体或抗人Pgp单克隆抗体（抗体浓度稀释1∶1 000）检测样本中的GCS蛋白或P-gp蛋白。最后采用ECL试剂 （Amersham 公司产品）曝光显色。
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