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抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：王婉，高媛，杨金菊，柳晓兰，鞠艳芳，刘莉，陈志成 刘蓉，
迟俊，邢维贤，高建恩，安立国，孙启鸿
【摘要】 本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDPglucose pyrophosphorylase 2）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白，用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定，通过UniZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性。结果表明：通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2 mAb 的杂交瘤细胞系BAD062，其分泌的单克隆抗体的Ig亚类(型)为IgG2b (κ)，Western blot 结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56 kD的蛋白；应用单克隆抗体BAD062对人肝脏cDNA表达文库（UniZAP XR）进行筛选，阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2。结论：单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2，该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验，为UGP2的研究提供了有力的工具。
【关键词】 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2 单克隆抗体 cDNA表达文库
Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Against
Abstract The study was aimed to generate monoclonal antibodies (mAbs) against homo sapiens UDPglucose pyrophosphorylase 2 (UGP2). Normal human liver tissues homogenized, and cytosolic proteins isolated by centrifugation were used to immunize BALB/c mice to generate mAbs by hybridoma technique. The mAbs were identified by ELISA, Western blot, and immunohistochemistry assay. The antibody specificity was confirmed by UniZAP expression library screening. The results indicated that one hybridoma BAD062 secreting specific mAb against UGP2 was established. The Ig subclass of this mAb was IgG2b (κ), and it could be used in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay. The antigen recognized by BAD062 mAb was localized in the hepatocyte cytoplasm, with molecular weight of 56 kD in the cytosolic proteins of human liver tissue. The BAD062 mAb was further confirmed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. It is concluded that a hybridoma cell line stably secretes specific mAb against UGP2. This mAb reacted with UGP2 in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay, and would be very useful for the UGP2 studies.
Key words UGP2; mAb; cDNA expression library
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDPglucose pyrophosphorylase2, UGP2）是糖原生物合成过程中的一种酶，由508个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）约为56 000，催化UTP与葡萄糖1P的反应, 生成UDP葡萄糖。UDP葡萄糖是主要活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢［1］。摄入人体内的葡萄糖可在葡萄糖激酶、葡糖磷酸变位酶和尿苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶（UGP2）的催化下形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。此外，UGP2还与腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）相偶联，形成ADPG，参与淀粉的合成［1,2］。在糖原合成和分解过程中该酶的缺陷即导致临床表现的糖原累积病。UGP2在骨骼肌中高表达，其次在肝脏中也有较高的表达量。我们应用成人肝组织胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，其中1株为鼠抗人UGP2单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究UGP2在糖蛋白代谢中的作用奠定了基础。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3) 抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定材料和方法
材料
免疫和筛选用成人肝组织胞浆总蛋白，由本室制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。
成人肝组织胞浆总蛋白抗原的制备
取10 g正常人肝组织加40 ml匀浆缓冲液［3］，以每分钟700-750转速率制成肝组织匀浆，然后10 000×g离心10分钟，取上清，即获得成人肝组织胞浆总蛋白；采用BCA法测定蛋白浓度，SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量。
鼠抗人mAb的制备
将成人肝胞浆总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给BALB/c小鼠多点皮下注射。首次免疫后4周，再加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，用ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术制备mAb。
mAbs的鉴定
Western blot 分析 线粒体总蛋白经SDS－PAGE后，电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1小时，然后加入1∶2 000稀释的mAb，室温下孵育2小时（或4℃过夜），TBST缓冲液洗膜后，加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释），室温下孵育1小时，TBST缓冲液洗膜后，ECL法显色。
免疫组织化学鉴定 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片，PBST浸洗5分钟后每个组织片滴加25 mg/L的亲和素（avidin) 50 μl，室温孵育15分钟，滴加3% H2O2甲醇，室温孵育15分钟。滴加正常羊血清室温下封闭30分钟，加入1∶100稀释的鼠抗人PDCE2 mAb，4℃孵育过夜。以PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP，37℃孵育30分钟，用PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后封片。
抗体识别抗原的鉴定
UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选：取大肠杆菌XL1BLUE MRF'过夜培养菌接种于LB培养液中，37℃震荡培养至OD600为0.7左右， 11.5×g条件下离心10分钟，用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至OD600为0.5，取适当稀释的文库60 μl（含约50 000个噬菌体）与600 μl重悬的XL1BLUE MRF混匀后37℃温育20分钟，铺至150 mm的NZYLB平板上，42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见，将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面，37℃继续培养3.5小时，用防水墨水定位后，剥离滤膜，进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆，用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、测序。
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