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S-100蛋白与Cathepsin D在先天性巨结肠诊断中的应用(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：陈卫坚，周小渔，李梨平，贺新玉，范丽明
【摘要】 目的 观察S-100蛋白（S-100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）在先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）中的表达。方法 应用免疫组织化学染色观察25例HD患儿及10例对照组儿童结肠。结果 （1）在正常对照组与HD扩张段组肠壁肌间和黏膜下层可见CAD只对神经丛中神经节细胞阳性表达，对神经纤维与神经胶质细胞均不表达。S-100染色与CAD染色相反，神经纤维与神经胶质细胞均阳性表达，神经节细胞阴性表达，表现为阳性神经丛中细胞状“空白区”。（2）在HD狭窄段组肠壁神经丛中缺乏CAD阳性表达。S-100染色神经丛中细胞状“空白区”未观察到；S-100强阳性表达的神经纤维束显著增生，扭曲呈波浪状。结论 S-100和CAD的免疫组化染色对诊断HD具有重要意义。
【关键词】 先天性巨结肠 组织蛋白酶D S-100蛋白
Application of S-100 protein and cathepsin D in diagnosis of Hirschsprung’s disease
【Abstract】 Objective To observe the expression of S-100 protein(S-100) and cathepsin D(CAD) in the colon of patients with Hirschsprung’s disease(HD).Methods Colons from 25 children with HD and 10 controls were stained for S-100 and CAD by immunohistochemistry.Results (1) In the controls and the dilated intestine segment of the HD，CAD-positive ganglionic cells were observed in myenteric and submucosal plexus. S-100 positive nerve fibers and gliocyte stained were negative to CAD. The ganglionic cells-like blank area in the plexus stained were negative to S-100. (2) In the stenotic segment of HD，neither CAD-positive neurons nor cell-like blank area in S-100 stained were found in the plexus.S-100 positive fibers were proliferated obviously and wave-like in their appearance.Conclusion The expression of S-100 and CAD immunohistochemistry-staining has an important significance to the confirmed diagnosis of HD.
【Key words】 Hirschsprung’s disease cathepsin D S-100 protein
先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）是小儿外科常见的消化道畸形，主要病理改变是远端病变段肠管神经节细胞缺如。在HD的病理诊断中，有部分病例，尤其是新生儿病例，由于肠壁神经系统发育不完全，神经节细胞欠成熟，形态不典型，与神经丛中神经胶质细胞难以鉴别。而且多数患儿并发肠道感染，肠壁内有较多炎细胞浸润，使HE切片中神经节细胞难以辨认。这些原因均可造成HD不易明确诊断。本研究应用免疫组织化学（免疫组化）方法，观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经组织中S-100蛋白（S-100）和组织蛋白酶D（cathepsin D，CAD）的表达结果，加以分析，以明确诊断HD。
1 资料与方法
1.1 一般资料 回顾我院2002年6月～2004年6月临床拟诊断为HD的手术切除标本25例。男22例，女3例，年龄1个月～4岁，其中≤3个月10 例，>3个月15例，均经术后病理检查证实为HD，23例为常见型，2例为长段型。每例标本分别取近端扩张段切缘肠壁作为HD扩张段组，取远端狭窄段肠壁作为HD狭窄段组。10例横结肠或乙状结肠标本取自先天性无肛患儿造瘘术后切除的肠管，经光镜检查可见发育成熟的神经节细胞，作为正常对照组。
1.2 检测原理 CAD是一种天冬氨酸蛋白酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族。在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记。S-100是神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中，可作为肠道神经丛中胶质细胞和神经纤维的标记。
1.3 方法 标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋，连续切片，切片厚4μm，行CAD和S-100免疫组化染色。染色步骤采用非生物素两步法，用已知阳性的神经节细胞瘤作为阳性对照片，用PBS代替一抗作为阴性对照片，DAB显色。一抗、二抗及DAB显色剂均购自上海长岛抗体生物诊断试剂有限公司。一抗抗CAD抗体和抗S-100抗体工作浓度均为1∶60，鼠/兔通用型二抗工作浓度为1∶100。观察正常肠壁、HD扩张段和HD狭窄段肠壁神经丛中神经节细胞、神经胶质细胞及神经纤维的染色结果。
1.4 结果判断 棕黄色为阳性信号，CAD、S-100的阳性表达部位均位于细胞质。观察指标以“ 、 、 、-”表达染色的深浅。(-)为阴性染色，( )为弱阳性染色，( )为阳性染色，( )为强阳性染色。
2 结果
2.1 正常对照组
2.1.1 CAD 肠壁肌间与黏膜下层神经丛中可见CAD阳性染色的细胞状棕黄色颗粒（见图1），经与HE切片对比后证实为神经节细胞的胞浆。神经节细胞的染色强度不一样，肌间神经丛内神经节细胞着色强于黏膜下神经丛。神经丛中神经纤维和神经胶质细胞中CAD均为阴性染色。在黏膜和黏膜下层中，有散在组织细胞，呈CAD弱阳性染色。
2.1.2 S-100 S-100对神经丛中神经纤维和神经胶质细胞表达均为阳性染色，在阳性染色的神经丛中可以观察到一种特征性形态，表现为深染的神经丛中有细胞状“空白区”（见图2）。经与HE及CAD染色切片对照后发现细胞状“空白区”总是出现在神经节细胞的位置。
2.2 HD扩张段 CAD和S-100在HD扩张段肠壁的染色情况与对照组肠壁基本相同。
2.3 HD狭窄段
2.3.1 CAD 肠壁神经丛内缺乏CAD阳性染色神经细胞或神经纤维。
2.3.2 S-100 肠壁肌间与黏膜下层神经丛内均未观察到细胞状“空白区”。肠壁各层都可见S-100强阳性的神经纤维束显著增生，形态扭曲呈波浪状（见图3，4）。
正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S-100、CAD表达情况见表1。
表1 正常对照组、HD扩张段组和HD狭窄段组肠壁神经组织对S-100及CAD表达情况
注：n为标本例数
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