作者：费菲，陈宝安，黄成垠，李翠萍，裴孝平，仲悦娇，高峰，高冲

【摘要】 本研究探讨血小板衍生微粒(PMP)对脐血粒巨噬祖细胞集落形成单位（CFU-GM）的促增殖作用。采用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP，采用流式细胞术检测PMP的释放量，确定凝血酶的最佳实验浓度。应用Ficoll分离脐血单个核细胞（MNC），在含有不同浓度PMP的甲基纤微素半固体培养基中培养7天，观察CFU-GM集落形成情况。结果表明： 2.0、1.5、1.0 和0.5 U/ml凝血酶激活血小板后的PMP释放率分别为： 28.7%、47.7%、50.1%和43.9%；CFU-GM集落产率与PMP呈剂量依赖关系，PMP为10、50、100 μg/ml时的CFU-GM集落产率（个/2×105 MNC）分别为：119.8±32.2、142.8±45.2、180.8±85.1。50、100 μg/ml PMP组的集落产率与空白对照组（103.0±24.8）相比，P值均<0.05；而10 μg/ml PMP组的集落产率略高于空白对照组，但P值>0.05。结论： 用1.0 U/ml的凝血酶激活血小板释放的PMP较为均一，而且释放量最大。PMP可促进人脐血粒巨噬祖细胞的增殖。

【关键词】 血小板衍生微粒

　　Abstract This study was aimed to investigate the effect of platelet-derived microparticles (PMP) on stimulating the proliferation of granulocyte-macrophage progenitors (CFU-GM) from umbilical cord blood. Different concentrations of thrombin were adopted to activate the platelets for releasing PMP. Flow cytometry was adopted to evaluate the efficiencies of different concentrations of thrombin to produce PMP. Umbilical cord blood mononuclear cells (MNC) were obtained from healthy donors and the MNC were isolated by Ficoll density gradient centrifugation. MNC were cultured in 2.7% methylcellulose containing different concentration of PMP and colonies were counted under an inverted microscope after 7 days. The result showed that the release rate of PMP activated by 2.0，1.5，1.0 and 0.5 U/ml thrombin were 28.7%，47.7%，50.1% and 43.9% respectively. The PMP enhanced colony formation in dose-dependent manner. The number of colonies per 2×105 MNCs in groups of PMP at different concentrations (10，50 and 100μg/ml) were 119.8±32.2，142.8±45.2 and 180.8±85.1 respectively. The number of colonies in the groups of PMP at 100 μg/ml and 50 μg/ml were statistically significant when compared with control group (103.0±24.8) (P<0.05). The number of colonies per 2×105 MNC in the group of PMP (10 μg/ml) was 119.8±32.2 which was higher than that in control group，but there was no statistical significance between two groups. It is concluded that platelet activated with 1.0 U/ml thrombin can get the best release efficiency of PMP and PMP can enhance the proliferation of granulocyte-macrophage progenitor cells of umbilical cord blood

　　Key words platelet-derived microparticles; cord blood; granulocyte-macrophage progenitor cell

　　血小板衍生微粒（platelet-derived microparticles，PMP）是血小板激活后产生的直径为0.1-1.0 μm的小囊泡颗粒，含有多种特异性膜糖蛋白和生物学活性的受体，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应。研究表明，PMP可影响人类造血干细胞的多种功能：PMP可通过转移CD41抗原增强骨髓来源的造血干细胞对胶原蛋白的黏附能力；通过其表面CD40配体来增强骨髓来源的造血干细胞的生存能力；促进骨髓移植后免疫系统和造血功能的恢复等［1］。本实验将PMP与人脐血造血干细胞共同孵育，以观察PMP对脐血粒巨噬祖细胞集落生长的影响。

　　材料和方法

　　样品来源

　　10份脐血样品由南京大学医学院附属鼓楼医院产科提供。选择健康足月妊娠的产妇，胎儿娩出后立即结扎脐带，消毒后穿刺脐静脉，通过重力作用将脐血收集于200 ml抗凝的采血袋中；采血量为80-100 ml，4℃保存，8小时内分离单个核细胞（mononuclear cells，MNC）；血小板悬液由江苏省血液中心成份科提供，均为血细胞分离机采集的健康供血者的血小板。

　　试剂与仪器

　　重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)购自厦门特保生物工程股份有限公司；白介素－3(IL-3)购自晶美公司；甲基纤维素为Sigma公司产品；IMDM为Gibco公司产品；淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）购自上海恒信公司；流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品；标记抗体CD61-FITC为Immunotech公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

　　脐血单个核细胞的分离

　　留取的脐血样品经1 100×g离心10分钟，去除部分红细胞；混悬后，缓慢加入到含5 ml淋巴细胞分离液的15 ml离心管中(Ficoll液∶脐血＝1∶2)，常温条件下，1 100×g离心20分钟。然后用吸管吸取中间白膜层的MNC至另1无菌试管内，用生理盐水洗涤2次后，再加入IMDM溶液洗涤1次（均400×g离心，8分钟），调整细胞浓度为8×106/ml备用。

　　血小板衍生微粒的制备

　　将血小板悬液经1 100×g离心10分钟（22±2℃），沉淀悬浮于缓冲液中(9 mmol/L Na2EDTA、26.4 mmol/L Na2HPO4、 140 mmol/L NaCl)，并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(137 mmol/L，NaCl、12 mmol/L NaCHO3、 5.5 mmol/L 葡萄糖、 2 mmol/L KCl 、1 mmol/L MgCl、0.3 mmol/L NaHPO4)。调整血小板浓度为8×108/ml。分别采用2、1.5、1.0和0.5 U/ml的凝血酶激活血小板（放37℃恒温摇床上振荡30分钟）。激活后的血小板离心（4℃，2 800×g离心20分钟），分离上清于另1试管中，于4℃，28 000×g离心1小时，并洗涤1次，然后沉淀悬浮于Tyrode缓冲液中［5，7］。

　　PMP的鉴定及定量

　　用等量1％多聚甲醛固定PMP后采用CD61标记PMP，选择直径1 μm的微粒以确定PMP直径阈值，并设定同型对照，用流式细胞仪分析不同浓度凝血酶作用后PMP释放的情况及PMP制备的纯度。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PMP的浓度，按试剂盒说明书操作。凝血酶激活的血小板用2％戊二醛固定，取1滴血小板悬液置于多聚-L-赖氨酸包被的玻片上，1％四氧化锇后固定，经乙醇逐级脱水、烘干、包埋、真空干燥、喷金后于扫描电镜下观察。

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