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盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：于江天，苏金，任婷婷，刘新平
【关键词】 盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化
【Abstract】 AIM: To find a way of detecting the ectopic expression of discoidin domain receptor 2(DDR2) in the cell and of tracing dynamically the expression distribution of DDR2 protein. METHODS: The fusion construct of DDR2 with EGFP was obtained by PCR amplication and restriction enzyme digestion, and transfected into 293T cells. The expression of the green fluorescence protein was examined by inverted microscope and the expression and activation of this fusion protein was confirmed by Western blot. RESULTS: DDR2/EGFP fusion plasmid was successfully constructed. Further analysis also demonstrated that the fusion protein has similar expression and activation pattern with wild type ones. CONCLUSION: The success in constructing the fusion plasmid DDR2/EGFP and in detecting its phosphorylation can lay a foundation of studying the function of DDR2.
【Keywords】 discoidin domain receptor 2, fusion vector, EGFP, phosphorylation
【摘要】 目的： 寻找使盘状结构域受体2（DDR2）在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径. 方法： 采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列，通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFPN3载体中，转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况. 结果： 成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体，进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活. 结论： DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化，为深入研究DDR2的功能奠定了基础.
【关键词】 盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化
盘状结构域受体2(Discoidin Domain Receptor 2, DDR2)属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶，可被天然纤维型胶原活化［1-2］，从而介导基质金属蛋白酶(MMP1,2和13)的表达［2-4］. 本实验室的前期研究［5-7］发现，DDR2在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平. 为了深入研究DDR2介导的信号转导过程，我们旨在克隆其cDNA序列并将其以易于检测的形式进行表达.
1材料和方法
1.1材料大肠杆菌DH5α菌种和293T细胞为本室保存；引物由赛百盛公司合成；克隆载体pMD18T, Taq酶, dNTPs, dATP, 各种限制性内切酶及T4连接酶（TaKaRa公司）；DMEM培养基和新生小牛血清（Gibico公司）；pEGFPN3表达载体和抗EGFP抗体（Clontech公司）；抗酪氨酸磷酸化抗体4G10（Upstate公司）；DNA提取及回收试剂盒（天为公司）；PCR模板为本室构建的pMD18TDDR2; Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）; Westernblot所用发光底物（Pierce公司）; Olympus IX71荧光倒置像差显微镜.
1.2方法
1.2.1引物设计将DDR2全长无终止码序列命名为WSFDDR2（Without Stopcode Full length DDR2），根据GenBank中人DDR2分子序列（编号NM_006182）设计引物如下： 上游引物UW 5′ GCAAGCTTCCAGTTCCAACACCATCTTCTGAG 3′，其中引入HindⅢ酶切位点；下游引物DW 5′ GCGGTACCCTCGTCGCCTTGTTGAAGGTGCAG 3′，其中引入KpnⅠ酶切位点.
1.2.2PCR扩增及产物修饰在100 μL反应体系中加入10×反应缓冲液10 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL，模板使用本室保留的pMD18TDDR2质粒稀释液6 μL, 10 μmol/L上、下游引物各4 μL, pfx高保真DNA聚合酶2 U，补水至100 μL. 扩增条件为94℃ 5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 68℃ 2 min，后3个步骤重复循环30次. 扩增产物回收后以30 μL TrisHCl（pH 8.0）溶解，并进行加“A”反应： 50 μL反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP, 25 mmol/L MgCl2 3 μL，扩增产物30 μL, rTaq酶0.5 μL，补水至50 μL，反应条件为72℃ 40 min.
1.2.3PCR产物克隆及序列测定将上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pMD18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和测序.
1.2.4重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2的构建用HindⅢ/KpnⅠ将测序成功的WSFDDR2片段从pMD18T载体中切下，并连接入pEGFPN3载体中，构建出重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2，并进行酶切鉴定（图1）.
1.2.5基因瞬时转染将293T细胞培养于含100 mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，按照说明书将pEGFPN3空载体和重组表达质粒pEGFPN3WSFDDR2用Lipofectmine2000转染入70%汇合的293T细胞.
1.2.6胶原刺激在293T细胞瞬时转染DDR2/EGFP融合表达载体16 h后，以无血清DMEM培养过夜，然后将30 mg/L的胶原加入到无血清DMEM培养基中继续与细胞孵育2 h.
1.2.7裂解细胞及Westernblot分析收取转染或经胶原刺激后的细胞，裂解获得总蛋白，裂解液的成份包括： 50 mmol/L HEPES（pH 7.5）, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 10 mL/L NP40, 2.5 g/L脱氧胆酸钠，10 mg/L抑蛋白酶肽，10 mg/L亮抑制肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟, 1 mmol/L Na3VO4和50 mmol/L NaF. 取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗孵育过夜，PBST洗膜，然后与辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗室温孵育1 h, PBST洗膜后加入发光底物孵育5 min，于暗室中用X光片曝光、显影、定影.
2结果
2.1人DDR2无终止码编码区序列的克隆及鉴定通过PCR扩增，成功获得长度为2565 bp的WSFDDR2片段（图2A），克隆入pMD18T载体后进行酶切鉴定时，由于pMD18T载体大小与 WSFDDR2分子大小接近，所以通过WSFDDR2片段内部已有的酶切位点BamHⅠ鉴定（图2B），酶切产物凝胶电泳见1200 bp左右条带，表明鉴定成功.
2.2pEGFPN3WSFDDR2融合载体的构建测序成功的pMD18TWSFDDR2载体经HindⅢ/KpnⅠ/ScaⅠ三酶切，琼脂糖凝胶电泳显示出2500, 1700， 900 bp 3条条带，2500 bp为DDR2片段，1700 bp和900 bp条带是pMD18T经ScaⅠ酶切后的产物. 将2500 bp的片段回收后与HindⅢ/KpnⅠ双酶切后的pEGFPN3载体连接. 重组载体经酶切鉴定，可见到2500 bp左右的特异条带（图2C），pEGFPN3WSFDDR2融合载体构建成功.
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