作者：孙莉静，袁伟杰，张小瑛，梅小斌，郭志勇，陈光椿，张军

【关键词】 细胞凋亡

Effect of genistein on apoptosis and proliferation of rat mesangial cells cultured in high glucose

　　【Abstract】 AIM: To evaluate the effect of different concentrations of genistein on the proliferation and apoptosis of rat mesangial cells cultured in vitro in high glucose. METHODS: Mesangial cells were treated in different groups. Control group (low glucose 1 g/L without genistein) and experimental groups (high glucose 4.5 g/L with genistein 0, 1, 5, 10, 30 and 50 μmol/L) were established and incubated for 12, 24, 36 and 48 h. The proliferation effect of genistein on cells was measured by MTT method. Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from different groups, the terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique and flow cytometry using propidium iodide staining were performed to identify or quantify the apoptosis of cells. RESULTS: Quantitative analysis of apoptotic cells showed that the apoptotic rate of the mesangial cells treated with genistein for 24 h was significantly higher, in 10, 30 and 50 μmol/L genistein groups than that in normal control group (P<0.05). No significant difference of the growth inhibition was found in 0, 1 and 5 μmol/L genistein groups. The cell apoptotic rate increased in a positive manner of genistein concentration and culture duration. CONCLUSION: Genistein has an intrinsic capability of inhibiting the proliferation and inducing the apoptosis of mesangial cells in cultured high glucose and these effects are in a genistein concentration and time dependent manners.

　　【Keywords】 genistein；cell proliferation；apoptosis

　　【摘要】 目的：探讨金雀异黄素对体外高糖条件下大鼠系膜细胞（MC）增殖及凋亡的影响. 方法：对照组：低糖DMEM培养液（不含金雀异黄素），实验组：高糖DMEM培养液（含0，1,5，10，30，50 μmol/L金雀异黄素），各组分别培养12，24，36，48 h. 氮蓝四唑盐（MTT）法检测MC的增殖情况，DNA琼脂糖电泳、末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法、流式细胞术3种方法检测细胞凋亡情况. 结果：10，30，50 μmol/L金雀异黄素作用24 h可明显诱导细胞凋亡（P<0.05），而0，1，5 μmol/L作用不显著. 随着金雀异黄素浓度的增加，凋亡比例增加；同一浓度的金雀异黄素随着作用时间的延长，凋亡比例亦增加. 结论：一定浓度的金雀异黄素在体外高糖培养条件下，可抑制大鼠MC增殖，促进其凋亡，且与其浓度和作用时间有关.

　　【关键词】 金雀异黄素；细胞增殖；细胞凋亡

　　0引言

　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见和严重的并发症之一，是造成终末期肾衰的主要病因，具体发病机制目前尚不清楚. 近年发现大豆及大豆蛋白具有加速脂质清除、抗动脉粥样硬化、抗氧化等生物功效［1］，这些作用与其中所含的多酚类混合物－大豆异黄酮密切相关. 肾脏血管病变、高脂血症和氧自由基等是DN发生和发展的重要因素，大豆异黄酮的上述功能，暗示了它们可能对肾脏细胞具有良好的保护作用［2］. 目前此类物质对肾脏细胞直接影响的报道较少. 肾脏系膜细胞（mesangial cell, MC）是致病因子作用的主要靶细胞. 我们研究大豆异黄酮的主要生理活性成分―金雀异黄素对高糖培养下大鼠MC生长的影响如下.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　大鼠MC株38℃水浴复苏，生长于含60 mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养液中，7 d左右达融合状态，实验采用传代的第3代MC，进入实验后无血清（5 mL/L）培养，分别在金雀异黄素作用的12，24，36和48 h终止培养. 实验分为对照组：低糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度1 g/L不含金雀异黄素）;实验组：高糖无血清DMEM培养液（葡萄糖浓度4.5 g/L金雀异黄素浓度为０，1，5，10，30和50 μmol/L），空白对照组只加培养液无细胞. Genistein购自Sigma公司（Mr 270.2，纯度≥98%），取Genistein 5 mg溶于1.85 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配成1×10-2 mol/L母液，实验时按需要稀释成各浓度工作液. 细胞凋亡检测试剂盒购自宝灵曼公司，细胞周期检测试剂盒购自BectonDickinson公司，噻唑蓝(MTT)购自上海华舜生物试剂公司.

　　1．2方法

　　1．2．1MTT法检测细胞增殖MC生长于96孔培养板（1×104／孔），24 h后换不同浓度金雀异黄素的无血清培养液，培养结束后每孔加入MTT液20 μL，37℃，50 mL/L CO2继续培养4 h，反应结束后每孔再加入DMSO 150 μL，振荡至蓝紫色结晶完全溶解. 将溶解后的液体转至96孔酶标板，在A490 nm处以空白对照组调零，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度（A）值. 每组设4个复孔.

　　1．2．2DNA琼脂糖电泳检测细胞凋亡MC生长于6孔板（3×105／孔），培养结束后2.5 g/L胰酶消化，收集各组飘浮的细胞和用胰酶消化的细胞，3000 r/min常温离心6 min，加入0.5 mL DNA裂解液，37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 加20 g/L蛋白酶K 5 μL，55℃水浴过夜. 等体积酚、酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，２倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，自然晾干，加入pH 8.0的TE 400 μL摇匀，再加入10 g/L RNaseA 5 μL, 37℃ 50 mL/L CO2培养30 min. 酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提一次，２倍体积的无水乙醇沉淀DNA，5000 g低温离心15 min，750 mL/L乙醇洗2遍，自然晾干，加入TE 20 μL溶解，4℃保存. 琼脂糖电泳检测DNA纯度. 10 μL DNA溶液与4×上样缓冲液2 μL混匀后，于15 g/L琼脂糖凝胶100 V电压下电泳，紫外灯下观察并摄影.

　　1．2．3TUNEL末端标记法检测细胞凋亡MC生长于含消毒盖玻片的6孔板（3×105／孔），终止培养后按以下流程处理细胞：40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗盖玻片，2 mg/L蛋白酶K消化细胞，于37℃， 50 mL/L CO2培养20 min，PBS冲洗盖玻片，加入100 μL TUNEL缓冲液，37℃，50 mL/L CO2培养60 min，冲洗盖玻片，加入TUNEL标志物，37℃，50 mL/L CO2培养30 min，冲洗盖玻片，DAB显色10 min，蒸馏水冲洗，苏木素衬染，自来水返蓝，冷风吹干，明胶封固，60℃烤箱烤干. 显微镜下观察并照相，阳性标记细胞核为棕染棕黄色颗粒.

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