【关键词】 外胚间充质干细胞

　　Expression of human telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process

　　【Abstract】 AIM: To evaluate the activity of telomerase in ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process. METHODS: Ectomesenchymal stem cells of early human embryonic facial process were isolated and cultured in undifferentiated conditions by supplementing with leukemia inhibitor factor (LIF). Immunohistochemistry assay and image analysis were used to detect the expression extent of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) when cells were passaged for 1, 8, 15 and 22 times. Cells without LIF for 10 days were also evaluated. RESULTS: Ectomesenchymal stem cells expressed hTERT. The expression extent of hTERT decreased with the increasing times of passages. The differentiated cells didn't express hTERT. CONCLUSION: Though ectomesenchymal stem cells of early embryonic facial process have somewhat high telomerase activity, the telomerase activity at this level is not enough to prevent cells from senescence.

　　【Keywords】 ectomesenchymal stem cell； human telomerase reverse transcriptase

　　【摘要】 目的： 探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况. 方法： 体外培养妊娠50 d人胚胎面突外胚间充质干细胞，白血病抑制因子（LIF）抑制细胞分化，于第1, 8, 15和第22代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达并进行图像分析，同时检测无LIF抑制下，第5代细胞自发分化10 d端粒酶逆转录酶的表达情况. 结果： 外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶，表达强度随传代次数的增多而下降. 在分化状态，该细胞不再表达端粒酶逆转录酶. 结论： 早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性，但不足以抑制该细胞的衰老.

　　【关键词】 外胚间充质干细胞； 端粒酶逆转录酶

　　0引言

　　端粒酶在胚胎干细胞、生殖细胞、永生化细胞及大部分肿瘤细胞中表达，但在正常体细胞中一般不表达. 近来发现胎儿组织、正常人的骨髓干细胞等也不同程度地表达端粒酶［1-3］. 这表明更广泛的组织细胞可能存在端粒酶活性. 为了解面突外胚间充质干细胞作为多种终末细胞的来源细胞［4,5］，端粒酶是否有活性，表达的端粒酶是否可以阻止衰老的发生，我们通过检测与端粒酶高度相关的端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的表达，获取面突外胚间充质干细胞端粒酶表达的信息.

　　1材料和方法

　　1.1材料DMEM（低糖）/F12培养基、胎牛血清(FBS)、非必须氨基酸（NEAA）(Gibco, USA)；白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor， LIF）（Chemicon, USA）；抗HNK1 mAb, 抗hTERT多抗(Santa Cruz Bio，USA)；抗波形丝蛋白mAb（Vimentin）, LSAB免疫组化检测试剂盒（DAKO, USA）.

　　1.2方法① 面突外胚间充质干细胞的培养和鉴定： 50 d因外伤流产自愿捐赠的胚胎，切取上下颌突，分切为1 mm3大小， 2.5 g・L-1胰酶37℃消化20 min，血清中和，吹散，离心. 再悬并以1×106接种于100 mL培养瓶中，培养液为含100 mL・L-1 FBS, 0.1 mol・L-1 NEAA的DMEM/F12(1∶1)，并添加1×106 U・L-1的白血病抑制因子（ LIF），以使细胞保持未分化状态. 孵箱内静置50 min，约50%细胞贴壁，弃培养液，添加新培养液. 间充质细胞贴壁速度较上皮细胞贴壁快，利用其贴壁时间的差异进行初步分离，去除部分上皮细胞. 细胞长满90%时，弃培养液，加入2.5 g・L-1胰酶. 间充质细胞对胰酶的耐受性较差，先脱壁，而上皮细胞脱壁需要的时间较长. 将消化下来的细胞置于培养瓶中，1∶2传代，再次利用贴壁时间的差异分离上皮和间充质. 最初3代以1∶2传代，并在消化和传代时分离上皮细胞. 从第4代开始，以1∶3传代，并不再分离上皮. 免疫组化抗HNK1, Vimentin染色阳性鉴定细胞为外胚间充质干细胞；② 免疫组化检测及图像分析： 细胞传代时，于第1, 8, 15及第22代制备细胞爬片；同时，将第5代细胞培养于无LIF的培养液中，10 d后爬片. PBS 洗，40 g・L-1多聚甲醛固定后，按免疫组化检测试剂盒的程序进行抗hTERT染色. 每个样本随机选择30个细胞，利用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统检测阳性细胞的平均灰度值. 同时以舌癌Tca8113细胞系为阳性对照，胎儿皮肤成纤维细胞为阴性对照.

　　统计学处理：采用SPSS统计软件进行统计学分析（方差分析）.