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南宁市儿童ApoB基因Xba I位点多态性分析(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：胡鹏 经承学 覃远汉 陈萍 李铭芳 裴娟
【摘要】 目的 研究南宁市126名健康体检儿童载脂蛋白B(ApoB)基因Xba I位点各基因型的分布情况，探讨其多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响。方法 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术检测126例健康体检儿童ApoB基因Xba I位点的基因型，计算体质指数（BMI），测定血清总蛋白（TP）、白蛋白（AIB）、球蛋白（GLO）、白蛋白/球蛋白（A/G）、脂蛋白a（LPa）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、非高密度脂蛋白胆固醇（nonHDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、载脂蛋白A1、(ApoA1)、ApoB、ApoA1/B、尿素氮（BUN）、肌酐（Ccr）及尿酸（UA）。结果 (1)Xba I位点各基因型的频率分别为X-/X-：9206%（116/126），X /X-：7.14%（9/126），X /X ：0.79%（1/126）；等位基因X-与X 的频率分别为9563%和437%；（2）等位基因X 组血清TP、AIB、A/G和ApoA1/B显著低于X-组，而BMI、LPa、TC、TG、nonHDL、LDLC、ApoB、BUN和Ccr明显高于X-组。结论 ApoB基因Xba I位点多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能有影响。
【关键词】 载脂蛋白B；基因多态性；体质指数；总胆固醇；儿童
儿童时期的血脂代谢不仅与生长发育、营养状况及肾功能密切相关，也是成年后心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的重要预示因子〔1〕。Everaldo等〔２〕认为，儿童暴露于各种有害环境因素的机会较成人少，所以环境因素对儿童血脂水平的影响较小，因此，是研究遗传因素对脂质代谢影响的最好群体。本研究选取在血脂代谢与转运途径中具有重要调节作用的基因载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）基因Xba I位点〔3〕，探讨其多态性对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响。
1 对象与方法
11 对象
2006年6月随机抽取126名南宁市健康体检儿童，其中男72名、女54名，年龄4～12岁，平均（72±32）岁,所有样本均取自稳态群体,符合HardyWeinberg遗传平衡定律（P>005）。
12 试剂与仪器
引物设计参照Scartezini等〔4〕报道，序列为：上游引物5′GGAGACTATTCAGAAGCTAA3′，下游引物5'-GAAGAGCCTGAAGACTGACT-3′（大连TaKaRa宝生物工程有限公司）； PCR扩增试剂盒（上海生物工程服务有限公司）；PTC220基因扩增仪（美国MJ公司）；Xba I内切酶（大连TaKaRa宝生物工程有限公司），血清指标检测试剂（上海执诚生物技术有限公司），LX20全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）；Gel Doc 2000凝胶成像分析系统（美国BioRad公司）。
13 基因组DNA提取
参考文献〔5〕。
14 PCR反应
50?μl反应体系中，10×缓冲液5?μl,dNTP(25?mmol/L Takara) 4?μl,上、下游引物各1?μl,模板DNA10?μl,双蒸水29?μl,二甲基亚砜1?μl。96℃预变性5?min后立即置于冰上,加入Taq DNA聚合酶(Takara)025?μl,94℃变性1?min,574℃退火1?min,72℃延伸1?min,循环40次,最后经72℃延伸10?min。取PCR产物5?μl在2%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下可见在710?bp位置出现一条明亮的条带。
15 酶切反应
20?μl反应体系中含10?μl PCR产物，2?μl牛血清白蛋白，2?μl 10×限制酶消化缓冲液，1?μl Xba I内切酶（10?U/μl Takara），灭菌注射用水5?μl。混匀后置衡温水浴箱中37℃酶切6?h。2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
16 体格检查
清晨空腹测量身高和体重，计算体质指数。
17 血清指标检测
空腹12?h以上清晨采静脉血，取血前最后一餐忌高脂饮食，总蛋白（TP）用双缩脲法测定；白蛋白（AIB）和球蛋白（GLO）用溴甲酚绿法测定；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和脂蛋白a（LPa）用酶法测定；高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）用选择沉淀法测定；非高密度脂蛋白胆固醇（nonHDL）=TC减去HDLC；低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）用液体双试剂法检测，ApoA1和ApoB以免疫比浊法测定；血浆尿素氮（BUN）、肌酐清除率（Ccr）和尿酸（UA）采用全自动生化分析仪检测。
18 统计分析
选用SPSS 115统计软件进行分析，基因型频率和等位基因频率计算采用直接计数法，不同等位基因之间的指标比较采用独立样本T检验。
2 结 果
21 Xba I位点各基因型的判定
PCR产物经过酶切后2%琼脂糖凝胶中电泳可得到3种结果。X /X 在433bp和277bp处出现2条带，X /X-在710，433和277bp处出现3条带，X-/X-仅在710bp处出现1条带。
22 Xba I 位点各基因型及等位基因的分布情况
共检出X /X 1例，占079%，X /X-9例，占714%，X-/X-116例，占9206%。根据平衡法计算出等位基因X 的频率为437%，X-的频率为9563%。
23 Xba I位点各等位基因之间指标比较（表1）
为了观察点突变所造成的Xba I酶切位点对儿童生长发育、营养状况、血脂代谢及肾功能的影响，将X /X 组与X /X-组合并成等位基因X 组，X-/X-组作为等位基因X-组，对各指标进行比较。结果显示，等位基因X 组血清总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白和载脂蛋白A1/B显著低于X-组，而体质指数、脂蛋白a、总胆固醇、甘油三酯、非高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、血浆尿素氮和肌酐清除率明显高于X-组。表1 Xba I位点各基因型之间的指标比较(略)
3 讨 论
本研究共检出X /X 1例，X /X-9例，X-/X-116例，根据平衡法计算出等位基因X-的频率为9563%，与文献报道非常接近〔６〕。ApoB基因Xba I位点多态性在血脂转运和代谢过程中发挥重要的调节作用，与高TG、高LDLC及高ApoB水平密切相关〔7，8〕。等位基因X 可能通过影响脂蛋白与细胞膜受体的亲合力，而导致体内LDLC分解代谢降低，致使血清LDLC水平升高；此外，X 还可能增加机体对环境因素的敏感性而影响儿童血脂水平。Verduci等〔9〕对82例苯丙酮尿症患儿ApoB基因多态性与血脂代谢的关系研究发现，携带X /X 基因型的患儿血浆LDLC水平显著高于其他基因型，建议应尽早给予低苯丙氨酸和低脂饮食。本研究结果也显示，携带等位基因X 的儿童不仅血清TG、LDLC和ApoB水平显著增高，而且LPa、TC和nonHDL水平也明显高于X-儿童。然而，有关Xba I多态性对儿童血脂代谢的影响仍存在争议。Islam等〔10〕跟踪研究214例具有冠心病家族史芬兰儿童ApoB基因多态性与血脂代谢的关系，发现Xba I变异并未对血脂水平产生明显影响。朱文丽等〔11〕对308名健康儿童研究发现，ApoB基因Xba I突变对血脂产生无影响，认为健康儿童的血脂水平受多基因的共同作用，Xba I单一位点产生的效应可能非常微弱。因此，建议在研究遗传因素对血脂代谢影响时，应采取多基因多位点的研究方法。儿童时期的血脂代谢与生长发育、营养状况及肾功能密切相关。本研究结果显示，等位基因X 组BMI、BUN和Ccr显著高于X-组，而血清TP、AIB和A/G则明显降低。由此可见，ApoB基因Xba I突变可以通过改变血脂代谢，对儿童的生长发育、营养状况及肾功能造成一定影响。Xba I位点的变异可作为一个基因标记点〔12〕，导致基因连锁不平衡，X 儿童具有肥胖倾向，更容易发生营养不均衡及肾脏损害。因此，对于携带等位基因X 的儿童，应通过调整饮食、加强锻炼、控制体重等措施来改善血脂代谢，并积极地预防高脂血症可能继发的肾脏损害。
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