作者：谯敏，向廷秀，王丕龙，黄爱龙

【关键词】 RNA干扰；环氧化酶

【Abstract】AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA targeting COX2 on the growth of gastric carcinoma cells of well, moderate or poor differentiation (MKN28, SGC7901, BGC823) and related mechanism. METHODS: siRNA targeting COX2 gene was designed, siRNACOX2 vector was constructed and transfected into gastric carcinoma cells to induce RNA interference. The changes of COX2 were detected with RTPCR and Western blotting.Cell viability was detected by MTT. Cell apoptosis was judged by TUNEL and electromicroscopy, and expressions of Bax and Bcl2 were tested by Western blot. RESULTS: Both COX2 expression and cell growth were inhibited in SGC7901 and BGC823 after transfection of siRNACOX2 vector into the cells. But, in MKN28 ,only COX2 expression decreased. The obvious cell apoptosis both in SGC7901 and BGC823 was observed. Bax was upregulated and Bcl2 was downregulated in SGC7901 and BGC823. In contrast, there were almost no changes in control group in vitro. CONCLUSION: RNA interference inhibits the growth of gastric carcinoma cells, which may be related to downregulation of COX2 and induction of cell apoptosis. The inhibitory effect of RNAi was relatively strong in SGC7901, which indicated that the effect of siRNA was dependent on the differentiation degree of gastric carcinoma cells.

【Keywords】 RNA interference; COX2; cell proliferation; apoptosis; stomach neoplasms

【摘要】目的： 利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术在体外抑制COX2表达，研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞（MKN28，SGC7901，BGC823）的可能性，探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法： 设计靶向COX2基因的siRNA，构建重组表达质粒pTZU6 1siRNACOX2并导入胃癌细胞株，体外诱导RNAi，采用逆转录PCR（RTPCR）和Western blotting检测COX2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记（TUNEL）及透射电镜检测细胞凋亡，Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl2的改变. 结果： pTZU6 1siRNACOX2质粒导入细胞后，SGC7901和BGC823中COX2表达明显下调，细胞生长被抑制，并出现特征性的细胞凋亡，同时有Bax蛋白上调和Bcl2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论： RNAi显著抑制胃癌细胞生长，可能与下调COX2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著，提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.

【关键词】 RNA干扰；环氧化酶2；细胞增殖；细胞凋亡；胃肿瘤

环氧化酶（Cyclooxygenase, COX）是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，其有两种同工酶. COX1是在正常组织中表达的结构型酶；COX2是诱导型酶，正常生理状态下表达甚少，而在各种刺激因子存在时表达增加. 有研究表明，COX2在胃癌中高表达［1］. 我们依据RNA干扰（RNA interference, RNAi）原理，以真核表达质粒pTZU6 1为载体［2］，设计并构建靶向COX2基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 作用于三种分化程度不同的胃癌细胞株，研究COX2基因特异的siRNA对胃癌细胞生长的抑制、可能的作用机制以及与胃癌细胞株分化程度的相关性，为COX2抑制剂应用于胃癌治疗提供理论基础.

1材料和方法

1.1材料中分化胃癌细胞株SGC7901和低分化胃癌细胞株BGC823细胞株由重庆医科大学病理生理学教研室提供；高分化胃癌细胞株MKN28细胞株购自上海消化疾病研究所；质粒pTZU6 1由重庆医科大学感染性疾病重点实验室黄爱龙教授惠赠；限制性内切酶XbaI, SalI, HindIII和EcoRI以及连接试剂盒购自美国TakaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Promega公司；总RNA提取试剂、RTPCR试剂盒购自美国Qiagen公司；转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；COX2，Bax和Bcl2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；COX2引物和内参GAPDH引物以及siRNA转录模板由北京三博远志生物工程技术有限服务公司和大连宝生物公司合成.

1.2方法

1.2.1siRNA结构的设计和合成根据siRNA设计原则［3］和COX2编码序列，设计19nt的DNA片段，中间为4个碱基的与目的基因无同源性的插入序列(TTCG)，末端终止子为TTTTT，并利用BLAST进行查询，确定其为特异性序列. 合成的DNA两端设计有XhoI或XbaI酶切位点，便于与pTZU6＋1载体连接. 设计合成pTZU6 1siRNACOX2转录模板序列（正义：5′ GCCTT CTCTAACCTCTCCT3′，反义：5′AGGAGA GGTTAGAGAAGGC 3′）；相应合成的干扰序列（正义：5′TCGAGGCCTTCTCTAACCTCTCCTTTCGAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT TT TT3′）（反义：5′CTGAGAAAAAAGCCTTCTCTAACCTCTCCTCGAAA GGAGAGGTTAGA GAAGGCC3′）.

1.2.2重组载体siRNA的构建内切酶SalI和XbaI酶切转录载体pTZU6 1，然后与纯化的双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下，4℃连接过夜，转化大肠肝菌JM109，Amp抗性筛选. 筛选克隆提取DNA，用EcoRI和HindIII双酶切，并用相同的酶酶切载体pTZU6 1作为对照，琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定. 构建的重组质粒命名为pTZU6 1siRNACOX2（简称siRNACOX2）.

1.2.3质粒转染细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 转染时，将细胞消化、离心并重悬后稀释为1×109个/L，以2 mL/孔接种于6孔培养板中，置37℃培养过夜. 于次日用siRNACOX2分别转染三种细胞，同时设pTZU6 1空载体转染的阴性对照和只接种细胞，不作处理的空白对照. 在无血清、无抗生素的RPMI1640培养液培养4~6 h后换新鲜的含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，继续培养2~4 d 后检测各指标.

1.2.4RT PCR检测COX2 mRNA采用RTPCR一步法试剂盒. 反应条件为50℃， 30 min，94℃ 5 min， 94℃ 55 s， 54℃ 55 s， 72℃ 55 s， 35循环. 以GAPDH作为内参，并设相应的阴性对照和空白对照. 扩增的COX2长度为270 bp，GAPDH长度为821 bp. 扩增产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min，EB染色，用BIORAD图像分析仪上观察并扫描制片，记录结果.

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