作者： 韦耿泽　王波，金振晓，武峰，胡玉珍，周京军

【关键词】 低钾；钠

　　Mechanism of low K buffer aggravating reperfusion injury in rat ventricular myocytes

【Abstract】 AIM: To study the role of calcium oscillations in reoxygenation injury induced by perfusion with a low K buffer in isolated rat ventricular myocytes. METHODS: The cells were firstly subjected to metabolic inhibition and anoxia for 25 min, then reperfused with normal ［K ］ (5.4 mmol/L) or low ［K ］ (3.0 mmol/L) Tyrode solution in the absence or presence of KBR7943, a selective inhibitor of the reversemode Na /Ca2 exchanger (NCX). The changes of ［Ca2 ］i were measured with spectrofluorometry, using Fura2 as Ca2 indicator. The changes in cell length were monitored and expressed as a recovery rate of cell length through the formula (endreperfusion length - endischemia length)/(initial length - endischemia length)×100%, reflecting the reperfusion injury. RESULTS: Compared with normal ［K ］ reperfusion group, reperfusion with the low ［K ］ Tyrode solution suppressed the recovery of cell length ［P<0.01, low ［K ］: (24.30±6.01)% vs normal ［K ］: (54.50±6.56)%, n=6］ and increased the total number of Ca2 oscillations ［P<0.01, low ［K ］: (138.80±9.54) vs normal ［K ］: 82.30±8.16, n=6］. However, these effects induced by low K reperfusion were significantly attenuated in the presence of 10 μmol/L KBR7943 ［P<0.01 vs low ［K ］ without KBR7943, n=6; Ca2 oscillations: 27.40±6.76, recovery of cell length: (58.90±7.30)%, respectively］. CONCLUSION: Reperfusion with low ［K ］ buffer increases reversemode NCX activities, which results in an increased calcium oscillations, thus aggravating cardiac injury.

【Keywords】 potassium deficiency; NCX; ventricular myocyte; calcium/metabolism

【摘要】 目的：观察低钾灌流液对大鼠心肌细胞再灌注时钙震荡的影响并探讨其作用机制. 方法：Ca2 荧光指示剂Fura2标记心肌细胞，在代谢抑制并低氧25 min后，改用低钾台氏液（［K ］=3.0 mmol/L）灌流，记录细胞钙震荡的变化. 以（再灌注末期细胞长度－缺血末期细胞长度）／（缺血前细胞长度－缺血末期细胞长度）×100%反映再灌注后细胞长度的恢复状况. 结果：与含正常钾浓度的灌流液对照组（［K ］=5.4 mmol/L）相比，在再灌注10 min内，低钾灌流液组出现钙震荡的次数显著增加(P<0.01，低K 组：138.80±9.54 vs对照组：82.30±8.16，n=6)，心肌细胞长度的恢复显著被抑制［P<0.01，低K 组：(24.30±6.01)% vs对照组：(54.50±6.56)%，n=6］；再灌注期间给予钠钙交换体反向交换模式抑制剂KBR7943，可显著抑制低钾溶液对钙震荡和细胞长度的影响［P<0.01 vs低K 组，n=6； 钙震荡：27.40±6.76和细胞长度恢复：(58.90±7.30)%］. 结论：低钾再灌注液通过增强反向钠钙交换体活性加重钙震荡，进而引发心肌损伤.

【关键词】 低钾；钠钙交换体；钙震荡；心肌细胞

细胞内钙（［Ca2 ］i）超载是缺血心肌在再灌注过程中细胞凋亡、坏死、以及心功能降低的重要原因［1］. 钠钙交换体（sodiumcalcium exchanger，NCX）是参与维持心肌钙稳态的重要转运体. 研究发现，在缺血／再灌注早期激活NCX反向交换模式（Ca2 进入细胞），将促发心肌［Ca2 ］i超载，导致心肌损伤［2-3］. 目前，Zhang等［4］采用膜片钳技术观察到，［K ］o升高可抑制NCX反向交换电流，而［K ］o降低则起促进作用. 如果再灌注早期［K ］o降低（［K ］o丢失），可能会通过促发NCX反向交换引起心肌［Ca2 ］i超载，从而加重心肌损伤. 本实验采用双激发荧光光电倍增系统检测细胞［Ca2 ］i的方法，观察低钾灌流液对缺血后再灌注早期心肌［Ca2 ］i震荡的影响，旨在探讨其可能的机制.

1材料和方法

1.1材料正常SD雄性大鼠（200~250 g）15只由第四军医大学实验动物中心提供. KBR7943英国Tocris公司；HEPES，I型胶原酶，BSA，谷氨酸钾，K2EGTA，Taurine，Fura2/AM和脱氧葡萄糖（Deoxyglucose）均为美国Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯；双激发荧光光电倍增系统为美国IonOptix公司产品. 正常K 浓度台氏液（mmol/L，Standard）：NaCl 140，KCl 4.2，MgCl2 1.0，KH2PO4 1.2，CaCl2 1.8，HEPES 10，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.4；低浓度K 台氏液（mmol/L，Low K ）：KCl 1.8，KH2PO4 1.2，其余成分与正常K 浓度台氏液相同. KB液（mmol/L）：Kglutamate 120，KCl 10，KH2PO4 10，MgSO4 1.8，K2EGTA 0.5，牛磺酸10，HEPES 10，glucose 20，用KOH调pH至7.2. 模拟缺血溶液：正常台氏液中去除glucose，并添加10 mmol/L脱氧葡萄糖，并持续充以纯N2，pH=6.4.

1.2方法

1.2.1心肌细胞分离按文献［5］的方法制备心室肌单细胞. 步骤：SD雄性大鼠断头处死，迅速摘取心脏并固定于Langendorff灌流系统，在37℃和通氧条件下依次用下述溶液灌流. ①含1.8 mmol/L Ca2 台氏溶液5 min；②无Ca2 台氏溶液15~20 min；③含0.5 g/L I型胶原酶以及1 g/L BSA的无Ca2 台氏溶液30~40 min. 灌流结束后，取左心室心肌组织，将其置于KB溶液中剪碎、吹打并过滤，获得单个心肌细胞，KB液中保存1 h后，将心肌细胞置于含10 g/L BSA 1.8 mmol/L Ca2 台氏溶液中备用.

1.2.2Fura2/AM负载［6］将心肌细胞混悬液置于离心管内，加入Fura2/AM（终浓度为1 μmol/L），于室温负载30 min，不断振摇，然后用含10 g/L BSA 1.8 mmol/L Ca2 台氏液洗涤数次，洗去胞外残留的Fura2/AM，静置30 min备用.

1.2.3细胞长度和心肌细胞［Ca2 ］i测定［5］取负载好Fura2/AM的细胞悬液加于0.5 mL灌流槽中，待细胞贴壁后，于倒置显微镜下选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无自发性收缩的心肌细胞，在室温下进行实验. 溶液灌流速度保持在1 mL/min. 通过摄像系统观察细胞长度的变化并储存于计算机，以便后续分析. 我们以（再灌注末期细胞长度－缺血末期细胞长度）／（缺血前细胞长度－缺血末期细胞长度）×100%反映再灌注后心肌细胞长度恢复率. Ca2 荧光信号的检测采用双激发荧光光电倍增系统. 75 W紫外氙光灯发射的光通过340 nm或380 nm的滤光片到达心肌细胞，细胞内与游离Ca2 结合的荧光物质被激发，其发射光在510 nm处被检测并通过光电倍增管记录. 细胞相继迅速被340 nm和380 nm激发光照射并交替扫描，细胞内游离Ca2 浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率所反映.

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