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Knockout血清替代品可提高C57BL/6J小鼠胚胎干细胞建系效率(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：王宏, 田海滨, 陈娟, 沙红英, 陈建泉, 成国祥
【关键词】 knockout血清替代品;,C57BL/6J小鼠;,胚胎干细胞;,建系效率
Knockout serum replacement improves establishment efficiency of C57BL/6J mouse embryonic stem cell line
[Abstract] AIM: To eliminate the influence of serum on selfrenewal of embryonic stem cells (ESCs), knockout serum replacement (KSR), a defined formulation, was used to replace serum for the establishment of C57BL/6J mouse ESC line. METHODS: C57BL/6J mouse blastocysts collected at 3.5 days post coitum (d.p.c.) were cultured in the medium supplemented with KSR. In control experiment, KSR was substituted by fetal bovine serum (FBS). When ESC line was established, the morphology of ESCs, the expression of alkaline phosphatase and oct4, and the karyotype and differentiating ability of ESCs were analyzed. RESULTS: 13 blastocysts were cultured in the medium supplemented with KSR and one ESC line (MES1) was established with a normal and stable XX karyotype after cultured for more than 20 passages, and then the high expression of alkaline phosphatase and oct4 was detected. When cultured in suspension, MES1 formed embryoid bodies. When inoculated subcutaneously into nude mice, MES1 formed teratoma. After injected into ICR mouse blastocysts collected at 35 d.p.c., MES1 incorporated into the inner cell mass of the host blastocyst and contributed to the development of a chimera. In control experiment, no ESC lines were cultured for more than 3 passages. CONCLUSION: KSR can be efficiently used to isolate and culture C57BL/6J mouse ESCs, which can eliminate traditional prescreening of FBS suitable for isolation and culture of ESCs.
[Keywords]knockout serum replacement; C57BL/6J mouse; embryonic stem cells; establishment efficiency
[摘 要] 目的: 在培养液中添加knockout血清替代品(knockout serum replacement, KSR)代替胎牛血清(FBS)用于建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞（ESC）细胞系, 以便消除血清中的不确定因子对ESC增殖的影响。方法: 以C57BL/6J小鼠3.5 d的囊胚为材料分离ESC, 比较KSR和FBS用于建立小鼠ESC细胞系的效率, 并通过体内、 外分化验证所分离获得的小鼠ESC 的发育潜能。结果: 培养液中添加KSR, 成功从13个小鼠囊胚中分离获得一个ESC细胞系(MES1), 体外培养传代超过20代仍保持未分化状态, 核型为正常XX型,碱性磷酸酶及oct4基因高表达, 悬浮培养可以生成拟胚体, 接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤, 注射到ICR小鼠3.5 d囊胚中, ESC可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。而培养液中添加FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。结论: 在培养液中添加KSR代替FBS适合于C57BL/6J小鼠ESC的分离与培养, 从而可避免实验前对所用血清的筛选。
[关键词]knockout血清替代品; C57BL/6J小鼠; 胚胎干细胞; 建系效率
小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)细胞系最早是在1981年由Evans和Kaufman以小鼠囊胚为材料, 体外培养分离获得。近年来, 由于小鼠ESC具有胚胎嵌合和生殖系嵌合能力[1]以及在特定条件下可定向分化[2, 3]等的特性, 因此在早期胚胎发育研究[4]、 基因打靶技术的改进[5]和利用细胞移植进行疾病的治疗[6]等研究领域得到了广泛的应用。然而影响小鼠ESC分离培养的因素很多, 很关键的一点是血清的质量[7]。实验室一般是先筛选出适合ESC生长的血清, 大量购置, 冻存备用, 这必然使实验操作较为繁琐。Knockout血清替代品(knockout serum replacement, KSR)是一种人工合成产品, 成份明确, 质量易于控制,因而应用该血清替代品将可避免实验前对血清的筛选。本研究中成功地以KSR替代胎牛血清(FBS)从C57BL/6J小鼠35 d囊胚分离获得ESC, 并可长期传代。分离获得的ESC发育多能性通过体内外分化以及嵌合体小鼠的制备得到验证。而采用FBS的对照组未能获得超过3代的ESC细胞系。从而证实KSR适合于C57BL/6J 小鼠ESC的分离与培养。
1 材料和方法
1.1 材料 细胞培养液DMEM, knockout DMEM, 细胞培养用PBS、 谷氨酰胺、 胰蛋白酶/EDTA、 青霉素、 链霉素、 秋水仙素、 非必需氨基酸、 FBS、 KSR以及Trizol试剂, 均为Gibco公司产品。明胶、 2巯基乙醇、 低熔点琼脂糖、 重组鼠白血病抑制因子（LIF）、 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、 底物DAB、 碱性磷酸酶染色试剂盒、 Giemsa染色液均为Sigma公司产品。丝裂霉素C为CalBiochem公司产品。反转录试剂盒购于Promega公司。抗体均购于Neomarkers公司。引物由宝生物工程有限公司合成。实验中C57BL/6J小鼠、 ICR小鼠、 裸鼠均购自上海实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 饲养层的制备 取135 d的ICR小鼠胚胎, 按常规方法制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts, MEF), 培养液为DMEM, 内含2 mmol/L谷氨酰胺、 100 mL/L FBS、 100 U/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素。待细胞长满后, 在培养液中加入终浓度10 mg/L的丝裂霉素C, 处理2、 3 h。经PBS清洗5次, 用2.5 g/L胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化, 按1×105/cm2密度将细胞接种到预先涂有1 g/L明胶的4孔板中备用, 用前更换培养液。
1.2.2 ESC细胞系的建立 收集35 d的C57BL/6J小鼠囊胚培养在制好的饲养层上, 培养液为Knockout DMEM, 内含150 mL/L KSR、 2 mmol/L谷氨酰胺、 0.1 mmol/L非必需氨基酸、 0.1 mmol/L 2巯基乙醇、 100 U/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素、 1000 U/mL LIF和10 ng/mL bFGF, 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养。4、 5 d后, 内细胞团（inner cell mass, ICM）细胞增殖旺盛, 此时将ICM离散成小的细胞团块, 接种到预先制好的饲养层上。5~8 d后, 出现的ESC集落可供建立ESC细胞系。以后每2、 3 d传代1次。对照组中培养液内用150 mL/L FBS替代KSR。
1.3 碱性磷酸酶活性检测 取指数生长期ESC, 用碱性磷酸酶染色试剂盒对ESC集落染色。
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