低温保存对白血病源性树突状细胞的影响(1)|医学论文|医药学论文

低温保存对白血病源性树突状细胞的影响(1)

http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览：次【打印论文】【收藏论文】

作者：黄友章，沈建良，王立新，向丹，郑培浩，岑坚，宫立众，刘毅，杨平地

【摘要】 本研究观察低温保存对白血病源性树突状细胞(LDCs)的生物学特性和功能的影响。取急性、慢性髓系白血病骨髓细胞，将其一部分细胞立即检测，一部分细胞立即培养，一部分细胞加入细胞保护剂低温保存一定时间复温后培养。细胞培养时，在细胞培养体系内加入组合细胞因子并培养12天，然后分别检测3组细胞的细胞形态、细胞免疫表型、混合淋巴细胞反应及细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应，并对结果进行相互比较分析。结果表明：　在细胞形态学方面，急性、慢性髓系白血病患者骨髓细胞在不染色或在瑞氏染色下仅见白血病细胞，而未观察到"树突状"细胞，但经组合的细胞因子培养后，均出现了"树突状"形态的细胞，低温保存前、后二者比较，无明显差异；在细胞表面免疫标志表达方面，经组合细胞因子培养的细胞与未培养的细胞相比，细胞表面表达的CD80、CD54、HLADR、CD1a、CD83、CD86明显上调，而CD14表达则明显下调，低温保存前、后的细胞在上述几种细胞表面免疫表达指标方面相比较无明显差异；低温保存后的白血病细胞经培养后，不仅有明显的混合淋巴细胞反应，而且在与T细胞作用后T细胞表面抗原CD8和CD25免疫标记细胞明显增多，明显地表现了CTL杀伤自体白血病细胞的效应。结论：　髓系白血病细胞在组合细胞因子培养条件下，可诱生为LDC；LDC的诱生在生物学特性方面不受低温保存的影响。

【关键词】 白血病细胞

Influence of Cryopreservation on Leukemic Dendritic Cells Derived from Leukemia Patients

Abstract This study was aimed to investigate the influence of cryopreservation on biological properties and function of leukemic dendritic cells(LDCs) derived from patients with acute or chronic leukemia. Some fresh leukemic cells were detected immediately; some were cultured immediately; some were cryopreserved in 80℃ with 5% DMSO-6% HES as cryopreservor. After being thawed , they were cultured. The combination of rhGMCSF, rhIL4, rhTNFα and other cytokines were added into the culture system. 12 days later, LDCs were assayed for morphology, immunophenotype, mixed lymphocytic reaction (MLR) and CTL cytotoxicity on autologous leukemic cells. The results showed that both fresh and cryopreserved leukemic cells obtained from patients with acute or chronic leukemia revealed typical DC morphologically by means of using combinations of cytokines in culture, but there was no significant difference between preor post cryopreservations. LDCs also upregulated the expression of CD80, CD54, HLADR，CD1a, CD83 and CD86, and downregulated the expression of CD14, but there was also no difference as compared with LDCs befor cryopreservation. LDCs derived from leukemic cells were also capable of stimulating MLR and inducing CTL which could kill autologous leukemic cells obviously. It is concluded that leukemic cells, regardless of fresh or frozen, can induce LDCs after culture with cytokine combination. The LDCs can induce CTL targeting autologous leukemic cells, and may be used to treat MRD as immunotherapy. The induction and biological properties of LDCs are not influenced by cryopreservation.

Key words leukemic cell; dendritic cell; cryopreservation

白血病化疗后的复发率高达90％以上，即使造血干细胞移植后也有一定比例的复发，复发原因是因为存在微小残留病（MRD）。针对MRD的治疗，目前有化疗、免疫治疗等手段，其中树突状细胞（DC）介导的过继免疫治疗最具特异性和应用前景［1］，已知白血病细胞在细胞因子作用下可诱导生成DC，这种白血病源性树突状细胞(LDC)既能表达白血病抗原，又具有致敏T淋巴细胞的作用。致敏的T淋巴细胞可特异性杀灭白血病细胞。然而，在白血病初发时，由于白血病细胞多，肿瘤负荷大，免疫功能差等因素的影响，应用LDC治疗疗效差，如果在病人获完全缓解后，其体内白血病细胞已十分稀少，细胞免疫功能等也基本恢复，此时应用DC治疗MRD疗效应该明显。DC虽然可低温保存，但其功能会受到一定损伤［2］，若能在治疗前将白血病细胞先期保存，待白血病取得完全缓解时，复苏白血病细胞并诱生为DC，用自身DC进行过继免疫治疗，临床应用会十分方便，但急性、慢性髓系白血病细胞低温保存后诱生的白血病源性树突状细胞的功能如何？未见报道，本研究试图观察低温保存白血病细胞对白血病源性树突状细胞(LDC)生物学特性和功能方面的影响。

白血病细胞来源与分组

经临床、血液检查、骨髓细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学标准确诊的初发髓系白血病18例(M0 1例， M1 3例， M2 2例， M3 2例， M4 3例， M5 2例， M6 2例， CML 3例），研究用骨髓25例，其中2例在培养中失败，5例患者在治疗过程中骨髓未达到完全缓解)。在肝素抗凝下抽取患者骨髓>30 ml，一部分细胞立即检测(C组)，一部分细胞立即进行LDC诱导培养(T1组)，另一部分细胞低温保存，在患者白血病完全缓解时复温细胞后进行LDC诱导培养(T2组)。采集时患者的骨髓细胞形态分类： M0、M1、M2、M3和M4的原始粒细胞、早幼粒细胞占73.25%（36%-89%），淋巴细胞占4.75%（3%-10%）；M4和M5的原始粒细胞、幼稚单核细胞占45.6%（32%-71%），淋巴细胞占2.2%（1%-3%）；M6的原始粒细胞、早幼粒细胞占27%（25%-29%），原始、早幼红占14%（13%-15%），淋巴细胞占4%；CML的原始粒细胞、早幼粒细胞占5%（4%-7%），中幼粒细胞占37.3%（20%-50%），淋巴细胞占3%（2%-4%）。

细胞保护剂、白血病细胞低温保存与复温

取二甲亚砜10 ml、羟乙基淀粉12 g、白蛋白20 g、加入RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）内至100 ml，4℃冰箱预冷作为细胞保护剂。取白血病患者骨髓，将有核细胞调整至1×1010/L，置4℃冰箱1小时，缓慢加入等体积的保护剂，使二甲亚砜终浓度5%（V/V）、羟乙基淀粉终浓度6%(W/V)、白蛋白终浓度10%(W/V)。分装于聚丙烯小管(2毫升/管)，置80℃冰箱过夜，液氮液相中保存。待检定时，取出细胞小管，放入40℃水浴复温，小管内细胞全部融化后立即吸出细胞悬液，以5倍含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养液稀释， 400×g离心10分钟，去上清，洗涤1次，制成细胞悬液。

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