作者：张学军　温丽　王福旭　罗建民　潘崚　刘小军　杜行严　董作仁　杨世芳

【摘要】 　　为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ recombinanat mutant human TRAIL, rmhTRAIL）单用及与柔红霉素（DNR）联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测DNR 处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。 结果表明：rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用，DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性，与各药单独使用比较均有显著差异（P<0.05）；经DNR作用后，U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调，而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。 结论：在体外rmhTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖，rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用，其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。

【关键词】 rmhTRAIL；U937细胞；K562细胞；柔红霉素

　　Combined Effect of Recombinant Mutant Human TRAIL and Daunorubicin in Inducing Apoptosis of Leukemia Cell and Its Mechanism

　　AbstractThe aim of study was to investigate the combined effect of recombinomt muctant human TRAIL (rmhTRAIL) with daunorubicin (DNR) or alone on K562 and U937 leukemia cell lines and its mechanism. The fibroblasts (MRC-5) of normal-human embryonic lung were used as control cells. After being treated with rmhTRAIL and DNR or only with rmTRAIL, the cytotoxic effect and the apoptosis rate in K562, U937 cells were measured by MTT assay. The expression levels of TRAIL death receptor and TRAIL decoy receptor mRNA in these three cell lines were assayed by semiquantitive RT-PCR befor and after treatment with DNR. The results indicated that K562 and U937 were sensitive to rmhTRIAL. DNR had synergistic inhibitory effect with rmhTRAIL on the growth of K562 and U937 cell lines （P<0.05）. The expression level of DR4 and DR5 mRNA was significantly higher in K562 and U937 with combined treatment of rmhTRAIL and DNR than that in those alone, while the expressions of DcR1 and DcR2 mRNA were not influenced. It is concluded that in vitro, rmhTRAIL alone or in combination with DNR can obviously inhibite the growth of leukemia cell lines and induce cell apoptosis, DNR and rmhTRAIL have a synergistic inhibitory effect on growth of K562 and U937. The mechanism may correlate with the up-regulation of DR4 and DR5 of K562 and U937.
　　
　　Key wordsrmhTRAIL；U937 cell；K562 cell；daunorubicin

　　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis- inducing ligand，TRAIL）是新近发现的肿瘤坏死因子超家族成员,可特异性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显杀伤作用。野生型TRAIL在稳定性、溶解性及生物活性等方面存在不足，重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（recombinant mutant human TRAIL，rmhTRAIL）是由北京沙东公司对野生型TRAIL结构进行环化变构后的优化产品，弥补了上述不足。我们以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，检测rmhTRAIL单用及联合柔红霉素 （daunorubicin, DNR） 对人急性单核细胞白血病细胞株U937、人慢粒红白血病变细胞株K562的促凋亡作用，并在mRNA水平分析化疗药作用前后其两种TRAIL死亡受体DR4、DR5（death receptor 4、5）和两种TRAIL诱杀受体DcR1、DcR2（decoy receptor 1、2）表达的变化，探讨rmhTRAIL治疗急性白血病的可能性及其机理，为rmhTRAIL作为新的抗肿瘤生物制剂治疗血液系统肿瘤提供理论依据。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　RPMI 1640培养粉、MEM培养粉、TRIzoL试剂、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲亚砜（DMSO）均购自 Gibco公司。新生牛血清为杭州四季清生物公司产品。rmhTRAIL冻干粉由北京沙东生物技术有限公司提供。柔红霉素为意大利S.P.A公司产品。引物由北京赛百盛公司合成。随机引物、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶均购自美国Promega公司。

　　细胞株及培养

　　K562细胞株由本实验室提供，U937细胞株、MRC-5细胞株均引自北京沙东生物技术有限公司。3种细胞均在37℃、5% CO2恒温条件下饱和湿度培养箱中培养，K562、U937细胞株培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，48小时传代1次；MRC-5细胞株培养液为含10%新生牛血清的MEM培养液，72小时胰酶消化传代1次，均选用对数生长期细胞进行实验。

　　细胞生长抑制率的MTT检测

　　单独用药取对数生长期的K562、U937接种于96孔平底培养板，MRC-5用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制备单个细胞悬液接种于培养板，均每孔200 μl（终浓度为2×105/ml）。分别各自加入终浓度为8、40、200、1 000 ng/ml的rmhTRAIL、DNR，对照组细胞加等量培养液，每个浓度孔接种3个复孔，培养24小时后加入20 μl MTT（5 mg/ml），培养4小时，377.4×g离心10分钟，弃上清，加入二甲亚砜（DMSO）200 μl，震荡溶解甲月替结晶，酶标仪490 nm测光吸收值（A），计算细胞抑制率。公式为细胞抑制率=（1-A处理组/A对照组）×100%联合用药对3个细胞组分别加入终浓度为 8、40、200、1 000 ng/ml DNR，然后每个DNR组分别加入rmhTRAIL 8、40、200 ng/ml，每个浓度孔接种3个复孔，孵育24小时后处理，结果的计算同上。

　　两药协同作用判断标准

　　采用国内金（正均）氏公式［1］判断rmhTRAIL和DNR化疗药物的联合作用是否具有协同性。公式：Q=EA B/（EA＋EB－EAEB）。EA 为A药（rmhTRAIL）单独处理的细胞抑制率，EB 为B药（DNR）单独处理的细胞抑制率，EA B为两药合并处理的细胞抑制率。Q值介于0.85-1.15为单纯相加，介于1.15-2.0为增强，大于2.0为明显增强，介于0.85-0.55为拮抗，小于0.55位明显拮抗。

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