作者：吴俊杰，洪小珍，许先国，何吉，傅启华，严力行

【摘要】 为了研究部分D表型的分子机理，用间接抗人球蛋白方法(IAT)筛选弱表达的D变异体，PCR-SSP（polymerase chain reaction-sequence sepecific primer）方法扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列，用PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异。结果表明：从22例弱D中检测到10例部分D表型，其中D Va（Kou.）、D Va（Hus.）和D Va-like （YH.）各1例，D VI type Ⅲ表型7例。结论：10例部分D表型的分子机理得到明确，其中D Va（Kou.）、D Va-like （YH.）表型为国内首次报道。

【关键词】 Rh血型

　　Molecular Basis of Partial D Phenotypes in Chinese

　　Abstract To investigate the molecular basis of partial D phenotypes in Chinese，D variants with weak D expression was screened by using indirect anti-human globulin test ( IAT) method，the polymerase chain reaction-sequenc specific primer (PCR-SSP) method was employed to amplify RHD specific exons and their flanking regions. The amplification products were sequenced directly to determine the molecular basis of D variants. The results showed that ten cases of partial D phenotypes，including one case of D Va（Kou.），one case of D Va（Hus.），one case of D Va-like （YH.），and seven cases of D VI type Ⅲ，were detected from 22 cases of weak D phenotype respectively. All ten cases of partial D phenotypes had one RHD allele deleted. In conclusion，the molecular basis of ten cases of partial D phenotype was confirmed，including D Va（Kou.）and D Va-like （YH.）phenotypes reported firstly in Chinese population.

　　Key words Rhesus blood group; RHD gene; partial D; sequencing

　　Rh血型系统是目前已知的29个人类红细胞血型系统中最复杂的一个［1］。Rh血型的核心抗原包括RhD和RhCE（主要有ce、Ce、CE、cE 4种组合）蛋白，它们分别由1条417个氨基酸组成的肽链所编码。疏水性分析表明，它们都包括6个胞外环、12个跨膜区域和7个胞内环。RhD和RhCE多肽链仅有30-35个氨基酸的差异。D 抗原因为具有较强的免疫原性在临床上有重要的意义。对D抗原表位的分类已经从最初的7个细分到37个［1］。通过鉴定这些表位，可以明确部分D的具体表型。但是，目前针对这些表位的一系列单克隆抗体谱散布于国外一些大型的输血医学研究机构和血型参比实验室中，只有通过国外会议交流或者私人赠送的途径才能获得。因此，单克隆抗体的匮乏影响了部分D表型的血清学鉴定。另外一个有效的途径是从基因水平去研究D变异体的分子机理，明确其变异位点，从而鉴定部分D。目前，D变异体的分子机理研究已经有很多报道，但是对部分D表型的分子机理研究主要集中在白人、非裔黑人和日本人中，在中国人群中的相关研究报道很少［1］。我们从弱D中通过分子水平的研究鉴定了10例部分D表型，报道如下。

　　材料和方法

　　研究对象

　　以工作或者生活在浙江省的无偿献血员为研究对象。在2002-2004的3年研究期间，共收集到Rh阴性样本1 272例。根据抗D试剂说明，对Rh阴性血型做进一步的IAT实验确认，筛查得到22例弱D样本。对弱D样本做RHD基因序列分析，发现其中10例为部分D表型，12例为弱D表型。 本研究以10例部分D表型为研究对象。

　　Rh表型血清学鉴定

　　RhD表型鉴定采用常规盐水平板法或试管法，使用加拿大Dominion公司的NAVACLONETM混合单克隆抗D试剂（人单克隆IgM抗D，D175-2细胞株；人单克隆IgG抗D，D415 1E4细胞株）。根据试剂说明，盐水实验Rh阴性的Rh血型用IAT方法进一步确认。如果IAT实验阳性，并且直接抗人球蛋白实验阴性，则鉴定为弱D表型或者部分D表型；如果IAT实验阴性，则鉴定为Rh阴性。抗人球蛋白试剂用美国Immuco公司的兔源抗IgG。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为加拿大Titus公司的单克隆抗体。

　　基因组DNA提取

　　采用Puregene DNA 纯化试剂盒 (Gentra，Minneapolis，USA)，从枸橼酸钠抗凝的外周血中制备基因组DNA，严格按试剂说明书操作。

　　D杂合性检测和单倍体型推测

　　根据Perco等的方法［2］，用特异性引物u1-s和rnb31 PCR检测Rhesus hybrid box。如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失；反之，则不存在Rhesus hybrid box，没有RHD基因的缺失。最大可能的单倍体型根据RHCE基因的C/c和E/e等位基因和RHD基因是顺式共遗传，并且RHD基因缺失的单倍体型按cde推算。

　　PCR-SSP

　　参照Wagner等［3］和Legler等［4］的方法，根据RHD基因和RHCE基因内含子序列的差异设计10组特异扩增，包括RHD 基因外显子及其侧翼序列的PCR-SSP引物（表1）。PCR反应总体积50 μl，含模板DNA 1 μl（约25-50 ng），特异性引物终浓度250 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L（TaKaRa公司，中国大连），dNTP终浓度 200 μmol/L (Promega公司，美国)，Taq酶1 U（TaKaRa公司）。PCR扩增条件：95℃ 预变性5分钟，然后94℃ 变性30秒、64℃ (外显子1、2、3、7)/67℃ (外显子4、6、8、9、10)/ 60℃ (外显子5)退火30秒和72℃ 延伸1分钟，循环35次，最后72℃延伸10分钟。PCR扩增仪为PE2700（Applied Biosystems公司，美国）。Table 1. Primers used in specific amplification and sequencing of RHD exons and their flanking regions（略）

　　PCR产物直接测序

　　PCR扩增产物用PCR产物纯化试剂盒 (Qiagen GmbH，德国)纯化后，直接用于序列分析反应。序列分析反应采用“BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit”试剂盒，DNA聚合酶采用AmpliTaq DNA Polymerase（Applied Biosystems公司，美国），最后用ABI 377 测序仪 (Applied Biosystems公司，美国)作序列分析。

　　结果

　　D杂合性检测

　　10例部分D都可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失。

　　10例部分D的分子鉴定

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