HFCL细胞诱导HL60细胞分化和改变其基因表达谱的研究(1)|临床医学|医药学论文

HFCL细胞诱导HL60细胞分化和改变其基因表达谱的研究(1)

http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览：次【打印论文】【收藏论文】

作者：梁蓉，黄高昇，陈协群，白庆咸，王哲，董宝侠，王文清，张伟平

【摘要】 　　本研究探索正常人骨髓成纤维细胞样基质细胞（HFCL）对急性髓系白血病HL60细胞增殖分化影响的分子机理。采用流式细胞仪检测细胞周期，NBT还原实验和CD11b、CD14、CD13、CD33细胞表面抗原的测定检测细胞的分化；应用基因芯片技术检测HL60细胞与HFCL细胞共培养前后基因表达谱的改变，并采用半定量RTPCR、Northern blot对芯片结果进一步验证。结果发现，HL60细胞与HFCL细胞共培养后，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少；NBT阳性细胞增高，CD11b和CD14的表达增多，并有明显的统计学意义；基因表达谱改变的研究发现，在与HFCL细胞共培养后，HL60细胞中582 个基因表达上调，1 323个基因表达下调。结论： HFCL细胞能诱导HL60细胞部分分化，并能明显改变HL60细胞的基因表达谱，为研究基质细胞与白血病细胞之间的相互关系及重要信号分子传导途径或crosstalk等提供了新的线索。

【关键词】 急性髓系白血病　骨髓成纤维细胞样基质细胞　 HL60细胞；基因芯片；基因表达谱

　　Differentiation of HL60 Cells Directly Cocultured with HFCL Cells and Alteration of Their Gene Expression Profile

Abstract To study the molecular mechanism of the effect of fibroblastoid stromal cells (HFCL) from human bone marrow on the proliferation and differentiation in acute myeloid leukemia HL60 cells, the cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM); the cell differentiation was determined by morphology NBT test and flow cytometric detection for expression of CD11b, CD14, CD13 and CD33; the genes differently expressed between HL60 cells and HL60 cells directly cocultured with HFCL were detected by using Affymetric oligo microarray technique. The changes of expression in some key genes were confirmed by using RTPCR and Northern blot. The results showed that the percentage of G1 phase cells in AML cells cocultured with HFCL cells was higher than that without HFCL cells, and the percentage of S phase cells was lower. The NBT positive cells and the expression of CD11b and CD14 increased. It was found that after direct contact of HL60 cells with HFCL cells for 96 hours, the expression levels of 582 genes were upregulated, 1 323 genes downregulated. It is concluded that many genes may take part in the influence of HFCL cells on HL60 cells, which may give important insights into the important molecules and pathways or crosstalk involved in the interaction between the AML cells and stromal cells.

Key words acute myeloid leukemia; human bone marrow fibroblastoid stromal cell; HL60 cell; gene chip; gene expression profile

骨髓基质细胞是造血微环境的主要成分，通过分泌细胞因子、直接黏附，对正常造血具有调控作用［1，2］。和正常造血细胞一样，白血病细胞也依赖造血微环境存活。近年来国内外研究越来越发现，微环境在白血病细胞恶性克隆的选择、增殖、分化、迁移和凋亡中起重要作用［3，4］。我们研究发现，正常骨髓成纤维样基质细胞(HFCL)能抑制急性髓系白血病HL60细胞的增殖，抑制细胞周期，影响VEGF因子的表达［5］，但究竟通过什么分子机理目前还不清楚。基因芯片技术以其高通量、高灵敏度，为疾病基因表达研究提供了一种简洁实用的方法。据此，本研究采用Affymetric Genechip Human Genome U133A来检测HL60细胞与HFCL细胞共培养前后的基因表达谱的改变，并通过进一步的筛选和分析，以探索HFCL细胞对HL60细胞增殖影响的分子机理。

材料

正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL来源于正常人胎儿骨髓基质细胞，由中国医学科学院血液学研究所姜学英教授建系，军事医学科学院基础医学研究所张毅博士提供。人急性髓细胞白血病细胞株HL60为本室保存株。实验用细胞均处于对数生长期。IMDM、RPMI 1640培养为Gibco公司产品，新生牛血清为HyClone公司产品；全基因组表达芯片U133A（美国Affymetrix公司产品）；TRIZOL reagent（美国Invitrogen Life Technologies公司产品）；RNeasy Mini Kit （美国Qiagen公司产品）；Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit、Fluidics Station 400、Hybridization Oven 640、G2500AGeneArray Scanner、Microarray Suit Version 5.0、MicroDB Version 2.0、Data Mining Tool Version 2.0均为美国Affymetrix公司产品；pMD 18T Vector为TaKaRa大连有限公司产品；E.Z.N.APlasmid Miniprep Kit I为美国Omega Biotek公司产品；NucleoSpin Extraction Kit为美国Clontech公司产品；NorthernMaxTM Formaldehyde Load Dye为美国Ambion公司产品；DECAprimeTM II Random Priming DNA Labeling Kit为美国Ambion公司产品；ExpressHyb Hybridization Solution为美国Clontech公司产品；尼龙膜为美国Clontech公司产品；同位素［α32P］dATP购于北京亚辉生物技术公司。

体外共培养体系

对照组：单独培养HL60细胞。共培养组：先种HFCL细胞48小时后，再在已贴壁的HFCL细胞上直接加入悬浮生长的HL60细胞。

扫描电镜检测

观察白血病细胞和HFCL细胞共培养48小时的形态学表现。先把细胞铺片放入细胞培养皿中，把胰酶消化后重悬的HFCL细胞加入到培养皿中，于37℃含5% CO2的细胞培养箱中培养48小时后，再加入HL60细胞继续培养48小时，用PBS洗2次，送电镜室后，加入4℃预冷的3%戊二醛固定2小时，PBS洗2次，再用4℃预冷的1%锇酸固定1小时，脱水干燥后在S520型扫描电镜下观察细胞形态。

NBT还原阳性率测定

离心收集单独培养的HL60细胞及与HFCL细胞共培养96小时的HL60细胞，重悬于培养液中（细胞密度1×106/L），加入终浓度为0.1%NBT及100 μg/L TPA，于37℃，5% CO2培养箱中孵育30分钟，离心收集细胞涂片，进行WrightGiemsa染色，油镜下观察200个细胞，胞内有蓝紫色颗粒的细胞为NBT阳性细胞，计算阳性细胞率。

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