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胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 刘心 李博玲 徐波 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
【摘要】 目的 探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生物学特性，为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法 采用酶消化法分离人胎盘组织，60g/L羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，分别进行贴壁培养，观察不同来源MSC的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果 胎盘来源的贴壁细胞为一种混合性细胞，脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不均一的贴壁细胞，二者在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性，CD106、CD44在三种细胞均有表达。结论 胎盘和脐血来源的贴壁细胞具备间充质干细胞的基本特征。
【关键词】 胎盘；脐血；间充质干细胞
Comparison of the adherent cells derived from human placenta,umbilical cord blood and bone marrow
ABSTRACT: Objective To compare the adherent cells derived from human placenta, umbilical cord blood and bone marrow, and provide laboratory data for clinical application of mesenchymal stem cells. Methods Adherent cells were isolated from human placenta tissues by enzyme digestion, and mononuclear cells (MNC) were isolated from umbilical cord blood (UCB) by 60g/L HES and density gradient centrifugation and MNC were isolated from bone marrow (BM) by density gradient centrifugation, and then these cells were cultured in vitro. Their biological characteristics were studied and compared. Results The adherent cells cultured from human placenta and umbilical cord blood had disparate shape in vitro respectively. And they had some differences in growth and shape from those derived from bone marrow. The adherent cells derived from the three tissues all expressed CD106 and CD44 in immunohistochemistry staining. Conclusion The adherent cells derived from human placenta and umbilical cord blood have the basic features of mesenchymal stem cells.
KEY WORDS: placenta; umbilical cord blood; mesenchymal stem cell
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是成体干细胞之一，不仅支持造血系统，还具有多向分化潜能，在一定的实验条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞等[15]。因此，在细胞微环境和组织工程等方面具有广泛的应用前景。近年来，已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨髓、外周血、软骨、肌肉等组织中分离出来。这些组织均来源于胚胎发育期的中胚层，胎盘由滋养细胞及大量起源于中胚层的间充质和血管共同组成，亦有报道从脐带中分离培养出间充质干细胞[67]。因此，提示我们，与脐带同为胎儿附属物的胎盘中可能也含有MSC。本实验试从胎盘和脐血中培养出类似于骨髓来源的间充质干细胞的贴壁细胞，并对这三种细胞进行形态学观察，利用免疫细胞化学方法对其进行表面抗原的测定和比较，探讨其作为MSC新来源的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料 胎盘、脐血均采自本院产房。供者要求是身体健康的产妇，胎儿发育良好。新鲜骨髓标本采自本院门诊营养性贫血(骨髓呈增生象)患者。二氧化碳培养箱系美国谢尔登有限公司产品；SHELLAB1815TC型、胰蛋白酶、胶原酶、DNaseⅠ酶系Sigma公司产品；牛血清白蛋白(BSA)系Roche公司产品；胎牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料有限公司产品；LDMEM为GIBCO公司产品；小鼠抗人CD34、CD45单克隆抗体，兔抗人CD44、CD106多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2 胎盘、骨髓来源贴壁细胞的分离培养 在无菌条件下，剪取新鲜胎盘蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织，用含肝素的PBS反复冲洗，去除其血液成分。将绒毛膜层组织剪碎至约1mm×1mm×1mm大小，并尽可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分，加入含2.5g/L胰蛋白酶、1g/L胶原酶Ⅳ、0.1g/L DNaseⅠ酶的LDMEM，于37℃恒温摇床内消化30min。消化产物经200目无菌金属滤网过滤，去除未消化的组织。过滤后的细胞悬液用PBS洗2次，然后进行细胞计数。骨髓液经Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并计数。脐血经60g/L羟乙基淀粉和Ficoll密度梯度离心两步法分离出单个核细胞并计数。
以上三种来源的细胞计数后均用含100mL/L胎牛血清的LDMEM，在37℃、50mL/L CO2和饱和湿度下培养。贴壁24-48h后，换液去除悬浮细胞。继续培养，每3-4d换液1次。待细胞80%-90%融合后，胰酶消化传代。取3代以上传代细胞部分用于细胞化学染色，部分细胞液氮冻存备用，余者用于继续传代和诱导实验。
1.3 细胞诱导分化及染色 上述三种来源的原代贴壁细胞和传代细胞经胰酶消化后，分别接种于预放置有消毒无菌盖玻片(用于制备细胞爬片)的12孔板内培养，加入成骨诱导剂(地塞米松、β磷酸甘油、抗坏血酸，终浓度分别为10-8mol/L、10mmol/L、50mg/L)进行诱导分化，同时设置对照(仅含培养基)，每3d换液1次。分别逐日进行观察，细胞爬片用于细胞化学染色。
1.4 观察指标及鉴定 倒置显微镜下观察原代及传代细胞生长、增殖的形态特征、分布及形成时间。
贴壁细胞的鉴定：①细胞组织化学按文献[8]方法操作。取细胞载片，行瑞氏染色、非特异性酯酶(NSE)染色、过氧化物酶(POX)染色、糖原(PAS)染色和碱性磷酸酶(ALP)染色，光镜镜检。②免疫组化染色按文献[1]方法操作。取培养细胞载片行CD34、CD106、CD44、CD45等指标检测，显微镜下计数100个贴壁细胞，计算阳性率。
2 结果
2.1 MNC的分离培养 5份骨髓标本和9份胎盘组织分离培养后均获得了贴壁细胞。分离了7份正常脐血标本，平均获得MNC(1.55±1.15)×108个，有4份获得了贴壁细胞，获得率为57.1%。
2.2 贴壁细胞的形态特征 胎盘细胞刚分离时，细胞大小不均一，以单核的细胞为主，多核的细胞较少(图1A)。培养2-4d出现纤维样细胞，多核细胞大多融合或出现核固缩。约需1-2周左右，镜下可见贴壁细胞呈多样性。待培养3周后可见致密的贴壁细胞层。细胞形态由早期混合形态逐渐变为相对均一的梭形。细胞接近融合时呈条索状，集落中的细胞排列呈漩涡状或辐射状(图1B)，且贴壁牢、增长速度较快，用2.5g/L胰蛋白酶消化需要5-10min，传代后形态无明显改变，最多可以传10代。
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