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GFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2008-04-16 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：胡绍燕 陈子兴，赵晔，傅铮铮，何军，岑建农，谷敏
【摘要】 本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP1载体中，转化感受态E.coli菌细胞，筛选了阳性转化菌落，通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落，抽提重组质粒DNA；同时将重组质粒转染K562细胞，通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明： 通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体（pEWP）和含有WT1基因启动子和增强子的载体（pEWPE、pEWPA 和pEWPD）。转染48小时后，pEWP、pEWPE、pEWPA 和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光，而转染了空载体pEGFP1的K562细胞未出现荧光。结论： EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究，为进一步开展基因治疗创造了条件。
【关键词】 EGFP； WT1基因；启动子；增强子；K562细胞
Application of EGFP as Reporter Gene in Study of WT1 Regulation Elements
Abstract In order to investigate the feasibility of using EGFP as a reporter gene in WT1 transcriptional regulation study. WT1 promoter and enhancer were ligated into the vector pEGFP1 by recombinant DNA technique and confirmed by restriction enzymes digestion. The resultant constructs were transfected into K562 cell line by DMRIEC reagent and the function of these WT1 gene elements was detected by using a fluorescent microscope after transfection for 48 hours. The results indicated that the recombinant vectors, pEWP containing WT1 promoter, and pEWPE, pEWPA and pEWPD harboring both WT1 enhancer and promoter, had been successfully constructed. Fluorescence was observed in K562 cells transfected by pEWP, pEWPE, pEWPA and pEWPD, while no fluorescence could be detected in cells transfected by pEGFP1. It is concluded that EGFP gene as a reporter gene can be applied to the WT1 transcriptional regulation study, which provides the basis for gene therapy.
Key words EGFP; Wilms′ tumor gene; promoter; enhancer; K562 cell
WT1基因是一个参与转录调控的双相调节子，它与各种造血调控因子相互作用，在白血病发病过程中起重要作用。近十几年的研究证实，80％-90％的急性白血病中WT1基因高表达［1，2］，且随着病情的进展表达增高，被认为是一种“泛白血病”标志［3］，有可能成为白血病基因治疗和特异性免疫治疗的新靶点。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因及其载体是近年来研究活细胞中基因表达和蛋白定位的新型报道基因，已成功表达于多种原核生物和真核生物［4］。
本研究将WT1基因启动子、增强子片段连接到携带突变型绿色荧光蛋白报道基因而自身无启动子、增强子的载体pEGFP1中，通过检测瞬时转染后K562细胞的荧光强度以确定重组载体用于研究WT1基因转录调控功能的可行性，进而为研究WT1启动子和增强子用于白血病的基因治疗奠定基础。
材料和方法
主要材料
携带WT1启动子和增强子的质粒pCB.7e250（-）由美国Fraizer GC博士惠赠；pEGFP1载体购自 Becton Dickinson Biosciences公司。 E. coli DH5α为本实验室保存。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品；T4 DNA连接酶和限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SalⅠ、NotⅠ、HpaⅠ为MBI公司产品，AflⅡ和StuⅠ为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为Promega公司产品；Klenow片段为上海华美生物公司产品；PEG8000为上海生工公司产品。蛋白酶K、DNA分子量标准λ/HindⅢ、100 bp DNA Ladder、100 bp DNA plus Ladder、pUC19/MspⅠ购自MBI公司。卡那霉素、Xgal和IPTG为Sigma公司产品。脂质体DMRIEC为Invitrogen公司产品。荧光显微镜为Leica Q550CW型。
重组载体构建
WT1基因启动子的构建 取2 μg pCB.7e250（-）进行HindⅢ/PstⅠ双酶切，反应产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，切下WT1基因启动子片段，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒按说明书纯化凝胶中的DNA片段。WT1启动子与经过HindⅢ/PstⅠ双酶切的pUC18载体连接、测序，证实WT1基因启动子序列正确。再将WT1启动子与经过HindⅢ/PstⅠ双酶切的pEGFP1载体连接。
WT1基因增强子的构建 取20 μg pCB.7e250（-）进行BamHⅠ酶切，纯化的DNA片段与pUC18质粒连接、测序。将切下的WT1增强子片段分别插入载体pEWP的不同位点（MCS多克隆位点，NotⅠ位点和AflⅡ位点），通过粘端连接将WT1增强子与经BamHⅠ酶切后的pEWP连接，使WT1增强子连接到pEWP的多克隆位点上，通过平端连接将补平后WT1增强子分别连接到补平且去5′ 磷酸化的pEWP AflⅡ位点和NotⅠ位点上实现。
细菌转化
利用电穿孔技术将上述重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，取250 μl的电击转化细菌铺于含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基的琼脂板上，37℃倒置培养16-20小时。挑取阳性菌落扩大培养后，提取质粒进行酶切鉴定。
细胞培养与转染
白血病细胞株K562细胞于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。含体积分数15%胎牛血清（FCS）（杭州四季青公司）的RPMI 1640（Gibco/BRL）完全培养液进行常规培养。将4.0 μl的DMRIEC脂质体稀释于100 μl OPTIMEM无血清培养液中，同时取另1份100 μl OPTIMEMI无血清培养液稀释0.8 μg重组质粒，5分钟后将二者混合，室温放置45分钟以形成DNA脂质体混合物。用OPTIMEM无血清培养液调整K562细胞浓度，使其达到8×106/ml，每孔加入50 μl（相当于4×105细胞），再将DNA脂质体混合物滴入，5小时后补充40 μl胎牛血清和1 ml RPMI 1640完全培养液继续培养。于48小时用Leica Q550CW荧光显微镜在FITC滤光镜激发下观察细胞的荧光强度。
结 果
WT1基因启动子的构建与鉴定
pUC18/WT1启动子连接与鉴定 1 μg pUC18/WT1启动子连接产物进行HindⅢ/PstⅠ双酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，得到两个片段，大小分别为2.6 kb和652 bp（图1）。 测序结果显示WT1启动子的序列正确。
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