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参附注射液对阿霉素致心肌细胞钙超载的影响(1) |
| http://www.lunwenda.com 论文下载网 2009-02-28 浏览： 次 【打印论文】【收藏论文】 |
作者：闫福曼 周乐全 康亚丽 李小英 罗荣敬
【摘要】 【目的】观察参附注射液对阿霉素致心肌细胞钙超载的影响。【方法】选用SD大鼠随机分为正常对照组，正常生理盐水组，阿霉素组，阿霉素加生理盐水组，参附注射液低、中、高剂量组（剂量分别为0.3、0.6、 1.2g·kg-1·d-1）；除２个正常组外，其他组均采用阿霉素腹腔注射复制模型，参附注射液组同时给药2周；造模3周后急性分离单个心肌细胞，采用离子图像法检测各组心肌细胞内游离Ca2+浓度，膜片钳技术记录各组细胞膜上L型钙通道电流的变化。【结果】阿霉素组心肌细胞内游离Ca2+水平显著升高，细胞膜上L型钙通道的平均开放概率增加，平均电流幅度显著增大（P<0.05或P<0.01）；参附注射液高、中、低剂量均可显著降低心肌细胞内Ca2+水平，降低细胞膜上L-型钙通道的平均开放概率及平均电流幅度（均P<0.05），而各剂量组间作用无显著性差异（P>0.05）。【结论】参附注射液拮抗阿霉素所致心肌细胞钙超载的作用可能与其减少外钙内流、降低内钙释放有关。
【关键词】 参附注射液/药理学 阿霉素/毒性 钙超载 疾病模型 动物 大鼠
阿霉素(adriamycin，ADR)是临床上常用的蒽环类抗肿瘤药物，有抗瘤谱广、作用强的特点。然而，ADR具有严重的心脏毒性作用，出现剂量依赖性的心律失常，甚至心衰，和其他抗癌药物同时应用还可加重心肌的损害。因此心脏毒性成为ADR提高剂量或联合用药的主要障碍［1］。研究表明［2］，ADR心脏毒性作用机制主要集中在自由基的生成、细胞内钙超载、核酸的合成障碍和能量代谢障碍等方面。参附注射液是由人参(红参)、附片(黑附子)等中药提取物混合而成，主要有效成分为人参皂苷和乌头类生物碱，具有保护心肌超微结构、抗心律失常、增加冠脉血流量、抗脂质过氧化等作用［3］。参附注射液可减少ADR心肌毒性［4］，并通过抗自由基来保护阿霉素心肌损伤［5］。钙超载是阿霉素产生心肌毒性作用，导致心衰的一个重要因素［6］。本文从钙超载途径观察参附注射液对ADR心脏毒性的保护作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠，SPF级，体质量180～200g，雌雄兼用，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK粤2003 0001。
1.2 主要仪器与试剂 CK40型光学倒置显微镜 (日本Olympus)；ST4040型染色机(德国)；EG1160型石蜡包埋机(德国)；心脏Langendorff灌流系统由埃德仪器（上海）国际贸易有限公司提供；AXT0SK0P2型正置显微镜(德国ZEISS)；LP5150型TillVision图像处理系统（德国）；EPC9型膜片钳放大器（德国）；MP285型微电极拉制仪（美国）；Pulse＆Pulsefit和TAC数据采集和信号分析处理系统（德国）；阿霉素(浙江海正药业有限公司，批号20050507)；参附注射液(雅安三九药业有限公司，批号20043116)；牛血清白蛋白（BSA，Roche分装)；Ⅰ型胶原酶(Worthington，X6C8594，美国)；4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPPS）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）均购自Sigma公司。其他均为国产分析纯。
1.3 溶液配制 无钙台氏液：143mmol/LNaCl、5.4mmol/LKCl、0.3mmol/LNa2HPO4、5mmol/LHEPES、0.5mmol /LMgCl2、5mmol/LGlucose，用NaOH调至pH值为7.2～7.4。高钾溶液：70mmol/LLGlutamicacid、 25mmol/LKCl、20mmol/LTaurine、10mmol/LKH2PO4、3mmol/LMgCl2、10mmol/LGlucose、 10mmol/LHEPES、0.5mmol/LEGTA，用KOH调至pH值为7.2～7.4。电极内液：110mmol/LBaCl2、10mmol /LHEPES，用BaOH2调pH值至7.2～7.4。电极外液：140mmol/L天门冬酸钾、10mmol/LEGTA、10mmol /LHEPES、5mmol/LGlucose、0.001mmol/L河豚毒素（TTX），用KOH调pH值至7.2～7.4。
1.4 分组及给药 SD大鼠随机分为正常对照组，正常生理盐水组，阿霉素组，阿霉素加生理盐水组，参附注射液低、中、高剂量组（简称参附低、中、高剂量组）。每组8只，雌雄各半。正常对照组：不做特殊处理。正常生理盐水组：腹腔注射生理盐水。阿霉素组：实验开始后第2、4天腹腔注射1mg/kg ADR，第6、8天腹腔注射2mg/kgADR，第10、12天腹腔注射3mg/kgADR，第14、16天腹腔注射4mg/kgADR，16d累计用药剂量达20mg/kg；然后取左心室心肌组织，苏木素-伊红（HE）染色，镜下观察心尖处心肌细胞、细胞间质等的排列情况，确定造模成功与否。阿霉素加生理盐水组：造模后1周，腹腔注射等容积的生理盐水，每日1次，共2周。参附组：造模后1周，按高、中、低剂量组分别腹腔注射参附注射液0.3、0.6、 1.2g/kg，每日1次，共2周。
1.5 单个心肌细胞急性分离 造模3周后大鼠断头放血后，迅速取出心脏，放置冰水混合无钙台氏液去掉心脏的多余组织，保留一段主动脉，固定在Langendorff灌流装置上，用无钙台式液灌流，5～10min后转换成以含胶原酶I(0.5g/L)和牛血清白蛋白(1g/L)的无钙液灌流，灌流20～30min后将心室肌剪下，放入高钾溶液中吹打使细胞脱落，并于4℃保存于高钾溶液里，6h后进行实验。
1.6 钙浓度检测 将分离的大鼠心室肌细胞，以含钙1.0mmol/L的台氏液制备细胞悬液，贴壁于培养皿中，加入终浓度5μmol/L的荧光指示剂Fure2/AM负载，45min后以台氏液冲洗，然后在培养皿中加入有钙台氏液。将培养皿固定在荧光显微镜的载物台上，在TILLVISION中设置荧光激发方案，交替用波长340nm和380nm光波激发，曝光时间为40ms，每个循环之间时间间隔最短。用TILLVISION软件进行图像分析，记录340nm和 380nm处荧光强度（F），除去自发荧光后计算出F340/F380比值，用此值代表细胞内游离钙离子浓度。细胞选取标准为杆状，细胞膜完整，横纹清楚，细胞内没有空泡及颗粒。
1.7 单通道电流记录与分析 电极阻抗约为4～6mΩ。钳制电压-40mV，由-50mV到+30mV给予去极化脉冲，阶跃为10mV，持续时间200ms，采样间隔5s，以使钙通道从失活状态中恢复。用Pulse﹠Pulsefit进行数据采集，用分析软件TAC进行测量。
1.8 统计方法 采用SPSS 10.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 参附注射液对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响 阿霉素造模后，阿霉素组及阿霉素加生理盐水组心肌细胞内游离钙离子水平较正常对照组显著升高(P<0.01)；参附注射液可显著降低心肌细胞内游离钙水平(P<0.01)，但各剂量组间未见显著性差异(P＞0.05)，结果见表1。
表1 参附注射液对心肌细胞内游离钙离子浓度的影响（略）
Table 1 Effect of Shenfu Injection on the free calcium concentration of the myocardial cells
统计方法：单因素方差分析；①P<0.01，与正常对照组比较；②P<0.01，与阿霉素加生理盐水组比较
2.2 L型钙通道的鉴定 本实验采用110mmol/LBa2+作为载体离子流，Ca2+通道对Ba2+比对Ca2+有更大的通透性，且细胞外的Ba2+可以抑制K+通道，减少 K+电流的干扰。钳制电压为-40mV，指令电压依次为-50mV至+30mV，阶跃为10mV，给予去极化刺激，为在不同指令电压下可记录到内向单通道电流。-40mV电压下，钠通道已失活，排除了内向钠电流的影响。通道呈单开放形式，闪烁样开放，活动较少，在去极化全过程中均开放，电流幅度在 1.5pA至2pA左右。浴槽TTX可阻断Na+通道，故记录到的内向电流为L型Ca2+通道电流。
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